茯苓枸杞组合多糖的抗氧化活性研究

分别提取茯苓和枸杞多糖，将两者按照1：1组合得到组合多糖（PM），通过三种自由基清除试验以及过氧化氢氧化损伤的人正常肝细胞模型，检测多糖对细胞抗氧化活性。两种多糖和组合多糖均显示了较好的抗氧化活性，在过氧化氢造成的损伤肝L02细胞，组合多糖显示了显著的抗氧化作用，在浓度为100μg/mL时，L02细胞存活率最高。组合多糖可以明显下降过氧化氢损伤L02细胞的MDA浓度，并可以显著提高损伤细胞的两种抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力。

食品来源多糖（Polysacharide） 结构复杂，具有多种生物学功能，包括抗氧化、减轻炎症、降糖、降脂等功能。很多研究表明不同食品来源多糖具有较好的抗氧化的功能，其主要是通过促进抗氧化酶活性、减少自由基生成及抑制脂质过氧化来完成。有研究表明，不同组合多糖共同应用的抗氧化效果更强。人体肝脏的正常功能对于维持人体代谢非常重要，肝脏代谢非常活跃，其在不同生理状态下产生活性氧自由基，在一定的条件下引发的氧化应激认为会造成不同程度的肝脏细胞损伤，积累的自由基损伤会加速慢性肝病的形成和发展。目前在体外使用肝L02细胞的过氧化氢损伤模型，能较为有效的评价食品中活性成分的抗氧化能力。

茯苓，为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，《名医别录》中记载其能“调脏气，伐肾邪，长阴，益气力，保神守中”。枸杞味甘性平、补肾益精、补血安神。枸杞和茯苓配伍，具有健脾益肾的效果。

前期实验中，我们对不同种类食品来源提取的多糖进行了抗氧化能力的初步评价，发现其中茯苓和枸杞制备多糖及两者组合的多糖，在自由基清除等抗氧化活性评价中显示了较好的抗氧化能力，在此基础上，我们使用人正常肝细胞L02的过氧化氢损伤模型进行检测评估，试图为今后进一步的组合多糖应用提供可能的依据。

1.材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

枸杞，产自宁夏，为茄科植物枸杞Lycium barbarum L的干燥成熟果实。茯苓，产自云南，为多孔菌科茯苓属真菌茯苓Poria cocos P的菌核。它们购自广州至信中药饮片有限公司。1，1-二苯-2-苦基肼、抗坏血酸VC和MTT（噻唑蓝）均购自上海麦克林生化科技有限公司，MDA检测试剂盒、SOD检测试剂盒和GSH-Px检测试剂盒均购自上海碧云天公司。

旋转蒸发仪（型号EYELA，日本）、冷冻干燥机（宁波新芝）、全波长分光光度计（上海元析）、酶标仪（美国Thermo）、二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo）。

1.2 方法

参照两种不同方法提取枸杞多糖（LBP）和茯苓多糖（PP）。分别将购买的枸杞、茯苓清洗后烘干、研磨为粗粉，热水浸泡提取，经离心，醇沉，Sevage法除蛋白，然后透析，产物经冷冻干燥后制得样品。将制备的枸杞、茯苓多糖质量进行制备茯苓：枸杞（1：1）组合多糖（TP）。

自由基清除的检测，多糖浓度分别设置为1mg/mL、 0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL，VC作阳性对照，进行DPPH自由基清除率、 ·OH清除率测定和超氧阴离子自由基的清除率测定。

H2O2氧化损伤L02细胞的评价

细胞以1×104个/孔接种于96孔培养板中，每孔100μL加入完全培养液，设置正常细胞组、H2O2组、多糖组。细胞多糖组分别加入终浓度为0、25、50、100、200、400、800μg/mL的枸杞多糖、茯苓多糖和组合多糖的含血清培养液处理24小时，H2O2组和多糖各组都加入100μL含50μmol/L H2O2培养液，损伤4h，正常细胞组加入100μL培养液处理4h。用噻唑蓝染色法检测后获得细胞存活率。

设置正常组，H2O2组和筛选出的100μg/mL多糖浓度组，参照使用说明书检测丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力。

统计分析运用Graphpad软件对试验数据进行处理，数据以 x±s（标准差）表示，P<0.05 表示显著差异，P<0.01 表示差异极显著。

2.结果与分析

2.1 枸杞多糖、茯苓多糖、组合多糖清除DPPH自由基的检测

如图1，随着培养液中多糖浓度的增加，清除DPPH自由基比例逐渐升高。相同浓度时，组合多糖清除效果略强于两种多糖，枸杞多糖的清除率高于茯苓多糖组。组合多糖清除DPPH自由基能力在0.6 mg/mL时达到最高。

2.2 枸杞多糖、茯苓多糖和组合多糖清除·OH自由基的检测

由图2显示，随着浓度升高，枸杞多糖、茯苓多糖和组合多糖对·OH自由基的清除能力增强，清除比例增加。组合多糖浓度在0.2-0.4 mg/mL时，对·OH自由基清除作用强于其他多糖组，组合多糖清除·OH自由基能力在0.6 mg/mL时达到最高。

2.3 枸杞多糖、茯苓和组合多糖清除超氧阴离子自由基检测

图3显示，各组多糖随着浓度的升高，清除超氧阴离子自由基的能力先增强，但到0.6 mg/mL浓度时开始减弱，对O2-·自由基的清除能力均低于同浓度的VC溶液。在0.4mg/mL浓度时，组合多糖清除O2-·自由基最强。

2.4多糖对L02细胞保护浓度的测定

在之前的实验中，50μmol/L的H2O2与L02细胞共培养R0ahEuMJ//wZbcK8V92P9IWCr2lTw9i/vCjhiQQRBN4=4小时，细胞存活率约为50%，使用此条件对肝细胞进行损伤造模。如图4，在100μg/mL浓度，LBP组和PP组的存活率最高。组合多糖浓度在25、50、100μg/mL时，肝细胞活力高于同浓度的两种多糖。当组合多糖浓度是100μg/mL时，细胞存活率为84.3%，达到最高。

2.5 L02细胞抗氧化指标检测

如表1，过氧化氢损伤L02细胞后，与正常细胞组相比，损伤组的MDA浓度显著增加，损伤组的SOD和GSH-Px活力显著减低。多糖各组与过氧化氢损伤组相比，细胞MDA浓度降低，细胞的抗氧化酶SOD和GSH-Px活力均显著增加。其中组合多糖的两种抗氧化酶活性最高，明显高于单种多糖。

3.讨论

肝脏是机体代谢活动非常活跃的器官，肝脏细胞在代谢过程中线粒体产生大量的氧自由基（ROS），在一些特殊因素作用下，导致产生过量的自由基引起氧化应激会导致肝脏细胞的受损，这种损伤在一定范围内，细胞可以通过自身抗氧化酶的激活及其他清除自由基的方式来修复损伤，当损伤超出修复能力时候，细胞自身功能不能得到改善，将导致细胞衰老或者死亡。食品来源的一些多糖能够清除过量活性氧自由基，并维持细胞线粒体的正常生理机能，减少自由基对细胞的损伤。

在前期的实验中，我们对多种食品来源多糖进行抗氧化活性检测，根据之前实验的结果选择了枸杞和茯苓多糖，发现其多糖在清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的方面能力较强。在正常肝细胞L02细胞过氧化氢氧化损伤实验中，组合多糖浓度在100μg/mL时，细胞活力最高，与其他单种多糖相比，低浓度的组合多糖抗氧化能力更强。据此认为，组合茯苓枸杞多糖通过提高两种抗氧化酶的活性，降低丙二醛的浓度，减少了过氧化氢的氧化应激对肝细胞的损伤。

上述结果表明，组合多糖自由基清除能力与单种多糖相近，在肝L02细胞过氧化氢损伤实验中，低浓度的组合多糖与单种多糖相比，抗氧化能力更强。期待组合多糖后续应用于护肝功能添加。

基金项目

2022年广东省大学生创新训练项目“运动肽健康营养素”（编号：S202210573038）。

作者简介

王祈蘅（2002.11-），女，汉族，广东珠海人，本科在读；研究方向：生物技术。

*通讯作者

黄宏靓（1974.06-），男，汉族，湖南桂东人，博士，副教授；研究方向：生物技术。