基于斑马鱼模型对药食同源中药饮品的抗氧化和抗疲劳功效研究

2024-07-09孙博郑海云王超超刘玉洋王梦晓田孟尧王慧君赵海誉

安徽农业科学 2024年12期

孙博郑海云王超超刘玉洋王梦晓田孟尧王慧君赵海誉

摘要［目的］对2种药食同源中药饮品（香蜂悦颜饮、参杞固元饮）成分进行初步分析，并利用斑马鱼功效模型评价2种饮品的抗氧化和抗疲劳作用。［方法］通过UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS液质联用技术，用反相C18色谱柱，采用双压线性离子阱质谱正/负离子双重扫描方式，对样品进行成分分析；对水溶给予甲萘醌方法建立的斑马鱼氧化损伤模型加入梯度浓度（25、50、100 μg/mL）的香蜂悦颜饮稀释液干预，同时设置正常组、阳性药组，处理24 h后，Cell ROX避光染色，在荧光显微镜下观察拍照，计算斑马鱼的卵黄囊荧光强度；选择5日龄野生型斑马鱼，加入梯度浓度（25、50、100 μg/mL）参杞固元饮稀释液干预，同时设置正常对照组和阳性药对照组，处理18 h后，给药组水溶给予无水亚硫酸钠建立斑马鱼疲劳模型，并利用行为分析仪分析斑马鱼总运动距离。［结果］根据质谱检测数据，香蜂悦颜饮、参杞固元饮分别检测出63和60个化合物。与模型组相比，香蜂悦颜饮干预下的斑马鱼卵黄囊荧光强度显著变弱（P＜0.01）；与模型对照组相比，参杞固元饮干预下的斑马鱼总运动距离显著更远（P＜0.05）。［结论］2种药食同源中药饮品分别具有明确的抗氧化和抗疲劳作用。

关键词斑马鱼；药食同源；液质联用；抗氧化；抗疲劳

中图分类号 TS 275.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）12-0158-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.034

Study on Anti-oxidation and Anti-fatigue Effects of Medicinal and Edible Homologous Beverage for TCM Based on Zebrafish Model

SUN Bo1， ZHENG Hai-yun2， WANG Chao-chao1 et al

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicinal Sciences， Beijing 100700;2. Science and Technology Collaborating Center for Chinese Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700）

Abstract ［Objective］To analyze the chemical constituents in 2 medicinal and edible homologous beverage（Xiangfeng Yueyan Drink and Shenqi Guyuan decoction）， and evaluate the anti-oxidant and anti-fatigue effects. ［Method］UHPLC-TQ-Orbitrap-MS mass spectrometer and reverse phase C18 column were used to analyze the composition of the samples. The oxidative stress model established by aqueous menadione administration method was added with different gradient concentrations （25，50，100 μg/mL） of Xiangfeng Yueyan Drink dilution. Meanwhile， a normal group and a positive drug control group were set up. After treatment for 24 h， the Cell ROX was stained without light， and the fluorescence intensity of yolk sac was calculated by fluorescence microscope. Select 5-day-old wild type zebrafish and add different gradient concentrations （25， 50， 100 μg/mL） of Shenqi Guyuan decoction diluent. A normal control group and a positive drug group were set up at the same time. After treatment for 18 h， the fatigue model of zebrafish was established by aqueous solution of anhydrous sodium sulfite in the administration group， and the total movement distance of zebrafish was analyzed by behavior analyzer. ［Result］According to the mass spectrometry data， 63 compounds were detected in Xiangfeng Yueyan Drink and 60 compounds were detected in Shenqi Guyuan Drink. Compared with the model group， the fluorescence intensity of zebrafish yolk sac significantly weakened under the intervention of Xiangfeng Yueyan Drink （P＜0.01）;compared with the model control group， the total movement distance of zebrafish under the intervention of Shenqi Guyuan Drink was significantly longer （P＜0.05）.［Conclusion］The 2 kinds of medicinal and edible homologous beverage have clear anti-oxidation and anti-fatigue effects respectively.

Key words Zebrafish;Homology of medicine and food;LC-MS;Anti-oxidation;Anti-fatigue

基金项目中国中医科学院科技创新工程项目（CI2021A04012）。

作者简介孙博（1994—），男，黑龙江牡丹江人，博士研究生，研究方向：中药活性成分及中药新药开发。

*通信作者，研究员，博士，从事中药活性成分及生物学表征研究。

收稿日期 2023-07-11

近年来，中医药功能食品的研发在《“健康中国”2030纲要》等一系列政策文件出台下受到广泛关注［1］。作为助力人类健康发展、推动药食同源产业升级的重要抓手，药食同源品类中药材被开发成饮品，以期通过独特风味、清新口感、饮用方便和明确功效走进人们生活［2］。目前市场上的功能饮品的主要功用包括抗氧化、增强免疫力［3］和抗疲劳［4］。因此评价药食同源类功能性饮品有必要引入抗氧化、抗疲劳能力的生物学评价方法，直观反映产品的功效定位。

斑马鱼体型小，易饲养，繁殖迅速，所产幼卵能在72 h内完成胚胎发育。一方面，斑马鱼具有体外试验高效、快速、价低等优势；另一方面，作为一种完整的动物模型，斑马鱼可以对中药功效进行全方面、深层次的评价。目前，模式动物斑马鱼已在中药活性成分高通量筛选、药效评价等方面发挥重要作用［5-6］。

氧化剂甲萘醌可以产生活跃的半醌，通过体内氧化循环产生大量活性氧，从而诱导斑马鱼发生氧化损伤［7-8］；无水亚硫酸钠能与氧气反应，限制机体耗氧量从而构建斑马鱼疲劳模型［9］。该研究利用斑马鱼抗氧化评价模型、抗疲劳评价模型，分别评价2种药食同源的功能性饮品，同时利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS液质联用技术对2种饮品中的成分进行了鉴定，为后续中药类药食同源性产品（饮品）的功效评价和功效物质基础研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。

Ultimate 3000超高效液相色谱仪（含自动进样器、柱温箱、在线真空脱气机、低压四元梯度泵、PDA检测器），双压线性离子肼串联高分辨质谱仪，LTQ Orbitrap Velos Pro，美国Thermo Fisher公司；KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；高速冷冻离心机，美国Thermo Scientific公司；SZX7体式显微镜，奥林巴斯-中国有限公司；VertA1-CCD相机，上海土森视觉科技有限公司；Zebra Lab行为分析仪，法国ViewPoint公司；6孔板，中国Nest Biotech生物科技有限公司；CP214型精密电子天平，美国OHAUS公司。

1.1.2 试剂。

N-乙酰-L-半胱氨酸（批号I2016139，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；中华跌打丸［批号191112，广西梧州制药（集团）股份有限公司］；无水亚硫酸钠（批号I1428128，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲基纤维素（批号C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲基亚砜（批号BCCD8942，美国西格玛奥德里奇公司）；甲萘醌（批号I1817117，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Cell ROXTM Green Reagent荧光染料（批号2387260，美国英杰生命技术有限公司）。甲醇为美国Fisher公司色谱级甲醇；乙腈为美国Fisher公司色谱级乙腈；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.1.3 样品信息。

试验所用的2种药食同源中药产品香蜂悦颜饮、参杞固元饮，均为北京食喜健康科技有限公司生产。

1.1.4 试验动物。

斑马鱼来源于杭州环特生物科技股份有限公司，为野生型AB品系。抗氧化活性评价选用3日龄斑马鱼，抗疲劳活性评价选用5日龄斑马鱼。试验用斑马鱼饲养于28 ℃水温的专门水族箱，饲养用水的水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，pH为6.5～8.5，电导率为450～550 μS/cm，硬度为50～100 mg/L CaCO3。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液制备。

1.2.1.1 阳性药溶液。取N-乙酰-L-半胱氨酸用超纯水配制成12.5 mg/mL母液，现配现用。中华跌打丸粉碎后用超纯水溶解，并配制成200 mg/mL母液，现用现配。

1.2.1.2

供试品溶液。分别取香蜂悦颜饮、参杞固元饮原液，经0.45 μm微孔滤膜滤过后，分别按照不同浓度比例稀释，即得。

1.2.2 LC-MS 分析条件。

1.2.2.1 色谱条件。

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸-水溶液（A）- 乙腈（B）；梯度洗脱（0～5 min，2%～12% B，5～20 min，12%～30% B，20～27 min，30%～50% B，27～32 min，50%～95% B）；流速0.3 mL/min；进样量4 μL。

1.2.2.2 质谱条件。

采用电喷雾离子源（ESI）；正、负离子检测模式，扫描时间35 min；蒸发温度350 ℃；毛细管电压为-35 V，喷雾电压为-3.5 kV；鞘气流速35 L/min，辅助气流速10 L/min；喷雾电流100.00 kV；供试品和对照品溶液一级质谱在FT模式下进行全扫描，扫描范围m/z 100～1 200，二级质谱采用数据依赖性扫描；质谱数据采用Xcalibur软件采集和分析。

1.2.3

抗氧化活性评价。随机选取3日龄野生型斑马鱼于6孔板中，每孔容量为3 mL并放置30尾斑马鱼，分别设置正常组、模型组、阳性药组和香蜂悦颜饮组（试验组）。纯净水对样品原液进行稀释，水溶给药。除正常组外，其余各组均水溶给予甲萘醌建立斑马鱼氧化损伤模型。香蜂悦颜饮组的给药浓度分别为25、50、100 μL/mL。阳性药组选择的阳性药为N-乙酰-L-半胱氨酸，给药浓度为125 μg/mL。干预后，放置在28 ℃恒温培养箱，24 h后收集斑马鱼。利用Cell ROXTM Green Reagent荧光染料对斑马鱼内活性氧染色，30 min 后纯净水清洗3遍。各组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，以斑马鱼卵黄囊荧光强度的统计学分析结果评价样品抗氧化功效。

1.2.4

抗疲劳活性评价。随机选取5日龄斑马鱼于6孔板中，每孔容量为3 mL并放置30尾斑马鱼，分别设置正常对照组、模型对照组、阳性药对照组和参杞固元饮组（试验组）。纯净水对样品原液进行稀释，水溶给药。参杞固元饮组的给药浓度分别为25、50、100 μL/mL。阳性药对照组选择的阳性药为中华跌打丸，给药浓度为1 000 μg/mL。干预后，放置在28 ℃恒温培养箱。静置18 h后，除正常对照组外，其余各试验组均水溶给予无水亚硫酸钠造成斑马鱼疲劳状态。样品与无水亚硫酸钠共同处理后，每组随机选取10尾斑马鱼置于行为分析仪采集数据，分析斑马鱼总运动距离，以该指标的统计学分析结果评价样品缓解体力疲劳功效。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，统计学处理结果用mean ± SEM表示，P<0.05表明组间存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 香蜂悦颜饮成分分析

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术对香蜂悦颜饮的化学成分进行分析，结果见图1。通过测得的精确相对分子质量及二级质谱的碎片离子推测化合物的结构式，结合文献进一步比对，共鉴定推断出63个化合物，见表1。其中包括糖苷、皂苷、苯酚、环烯醚萜、黄酮等。这些成分主要来源于甘草、香蜂草、当归、栀子等。

2.2 参杞固元饮成分分析

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术对参杞固元饮的化学成分进行分析，结果见图2。通过测得的精确相对分子质量及二级质谱的碎片离子推测化合物的结构式，结合文献进一步比对，共鉴定推断出60个化合物，见表2。这些成分主要来源于人参、甘草、紫苏籽、山药、覆盆子、黄精、茯苓、猴头菇、针叶樱桃、枸杞。

2.3 香蜂悦颜饮的抗氧化活性评价

正常组和模型组斑马鱼卵黄囊荧光强度统计结果表明（图3～4），斑马鱼幼鱼经甲萘醌处理后，卵黄囊荧光强度显著上升（P<0.001），表明造模成功。香蜂悦颜饮组斑马鱼卵黄囊荧光强度统计结果表明，25～100 μL/mL的香蜂悦颜饮对模型斑马鱼存在抗氧化作用，并且随着干预浓度的上升，抗氧化作用逐渐加强。

2.4 参杞固元饮的抗疲劳活性评价

从图5～6可以看出，模型对照组斑马鱼的总运动距离明显比正常对照组有所缩短（P<0.001），表明造模成功。经中华跌打丸和参杞固元饮干预的斑马鱼（阳性药对照组和参杞固元饮组）总运动距离显著远于模型组，其中参杞固元饮100 μL/mL干预浓度下的斑马鱼运动距离最远且最显著（P<0.001）。

3 结论与讨论

该试验结果表明，通过甲萘醌建立的斑马鱼氧化损伤模型能够有效评价阳性药N-乙酰-L-半胱氨酸和香蜂悦颜饮的抗氧化作用，并体现出随干预浓度上升抗氧化能力也在上升的趋势。香蜂悦颜饮主要由香蜂草、甘草、当归、栀子等中药提取而成。香蜂草中迷迭香酸［10］、咖啡酸［11］、儿茶素［12］、原儿茶酸［13］均有明确的抗氧化作用。其中香蜂草中的香蜂草苷、木犀草素［14］以及甘草中的黄酮类化合物也是天然的抗氧化剂，有效清除体内自由基，防止不饱和脂肪酸过量氧化，减缓衰老。

无水亚硫酸钠影响机体耗氧量，从而减弱斑马鱼活动能力，但经阳性药中华跌打丸和参杞固元饮干预的斑马鱼，运动距离减弱较缓。特别是100 μL/mL参杞固元饮干预浓度下，斑马鱼无论活动距离和活动速度均基本与未经无水亚硫

酸钠干预的斑马鱼相当，一方面体现了抗疲劳模型对不同浓

度样品评价的灵敏度，另一方面也体现了样品有效性。参杞固元饮主要由人参、枸杞、甘草、黄精、猴头菇、茯苓等药食同源中药组成。其中人参皂苷类成分可促进血液循环、增加心脏供血量、提高心脏功能［15-16］，并且枸杞、黄精、茯苓、猴头菇中的多糖类成分也可以改善斑马鱼机体的血乳酸、血清尿素氮水平，提高抗疲劳能力以及增加运动耐力。

药食同源是中医药文化的重要组成，其研究和开发既有助于满足大众保健养生、健康生活的期许，也推动产品经济的发展。其中饮品类产品的发展潜力巨大，但目前中药类的此类产品认知度较低，对此类引入建立合理且普遍适应的功效评价模型，可以直观反映产品功效定位，来推动其市场潜力的充分发挥。

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