肝损伤对大鼠体内硫胺素及其代谢物水平的影响

叶倩利 张佳怡 刘李

摘要：文章为研究肝损伤对大鼠体内硫胺素及其代谢物水平的影响，通过14天胆管结扎和硫胺素限制饮食分别构建肝损伤和硫胺素缺乏大鼠模型，造模成功后，测定血浆和脑皮层中硫胺素及其代谢物浓度，并进一步分析了脑皮层中焦磷酸硫胺素依赖酶的活性和蛋白表达水平。结果表明：14天胆管结扎诱导的肝损伤大鼠与硫胺素缺乏大鼠的血浆和脑皮层中硫胺素浓度显著降低，但其代谢物焦磷酸硫胺素的浓度未发生改变，脑皮层中焦磷酸硫胺素依赖酶活性和蛋白表达也未发生改变。14天胆管结扎诱导的肝损伤和硫胺素限制饮食均会显著降低大鼠血浆和脑硫胺素水平，但不影响其代谢物焦磷酸硫胺素浓度及其依赖酶的活性和表达。

关键词：胆管结扎；肝损伤；硫胺素；焦磷酸硫胺素

中图分类号：R9  文献标志码：A

0 引言

硫胺素也称为维生素B1，是一种水溶性的维生素，同时也是影响脑能量代谢的关键物质［1］。大脑主要通过有机阳离子转运体（Organic Cation Transporters， OCTs）和硫胺素转运体（Thiamine Transporters， THTRs）从体循环中获取硫胺素［2］。硫胺素的代谢物焦磷酸硫胺素（Thiamine Pyrophosphate，TPP）是丙酮酸脱氢酶（Pyruvate Dehydrogenase， PDH）、α-酮戊二酸脱氢酶（Alpha-Ketoglutarate Dehydrogenase， KGDH）和转酮醇酶（Transketolase， TK）在催化各自底物进行生化反应时的辅因子［3］。TK能够将二碳单位从磷酸酮糖转移到磷酸醛糖上，促进磷酸戊糖生成途径中糖类的相互转换［4］。PDH可以催化丙酮酸生成乙酰辅酶A，从而将糖酵解、脂肪酸代谢与三羧酸循环联系起来［5］。KGDH主要催化三羧酸循环中的限速步骤，使α-酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶A［6］。这些TPP依赖酶在能量代谢中都发挥着重要的作用，因此硫胺素缺乏会影响TPP依赖酶的活性并阻碍脑内的能量代谢过程，使高度依赖葡萄糖氧化产生ATP作为能源的神经细胞受到干扰，引发大脑乳酸堆积和酸中毒，并导致中枢神经系统功能障碍，如认知功能下降等［7］。

长期缺乏硫胺素或长期过量饮酒（影响硫胺素吸收）会引起Wernickes脑病［8］，病人往往表现为精神和意识障碍、小脑共济失调和眼球运动障碍等，严重者出现昏迷，甚至死亡。Wernickes脑病与硫胺素缺乏密切相关［2］。肝性脑病人也呈现硫胺素缺乏（Wernickes脑病）相同的脑病理生理性改变，如脑内α-酮戊二酸脱氢酶活性降低、线粒体氧化作用缺失（ATP和磷酸肌酸降低）、脑乳酸蓄积、氧化/硝化应激、细胞能量代谢损伤和促炎细胞因子释放等［3，9］。临床报道显示，24例爆发性肝衰竭病人中有9例出现硫胺素缺乏［10］。有研究显示，在急性肝损伤病人中，血中硫胺素水平（55.2±6.7 nmol/L）显著低于正常人（81.8±10.2 nmol/L），伴随脑乳头状体变小等［11］。类似地，在阿尔茨海默病患者血浆中TPP浓度降低与脑内葡萄糖代谢受损程度正相关。在硫胺素缺乏小鼠脑内TPP浓度降低也与脑内葡萄糖代谢受损程度正相关［12］。在硫代乙酰胺（Thioacetamide， TAA）诱导的肝损伤大鼠脑内ATP的水平也显著低于对照鼠［13］。在吡啶硫胺素诱导的硫胺素缺乏大鼠中，脑内ATP和磷酸肌酸等高能磷酸化合物水平显著降低［14］。上述结果显示，硫胺素及其代谢物TPP是维持脑正常能量代谢所必需的，肝损伤引起血和脑硫胺素缺乏，可能损伤脑能量代谢，进而影响正常的神经功能。

本研究的主要目的：一是研究14天胆管结扎（Bile Duct Ligation， BDL）诱导的肝损伤是否会影响大鼠血浆和脑皮层中硫胺素及其代谢物水平；二是研究肝损伤状态下脑皮层中TPP依赖酶活性和蛋白表达是否发生改变。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

硫胺素（货号T283819）、TPP（货号T111202）、肝素（货号H104201）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）（货号D265376）、辅酶A水合物（货号C130754）、草酸钠（货号S112356）、鱼藤酮（货号R105076）、D-核糖-5-磷酸二钠盐（货号R141013）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；单磷酸硫胺素（货号929557）（Thiamine Monophosphate， TMP）、甘油磷酸异构酶（货号G2267）、磷酸丙糖异构酶（货号T2391）购自美国 Sigma 公司；总胆红素（货号C019-1-1）、直接胆红素（货号C019-2-1）、血氨（货号A086-1-1）、总胆汁酸（货号E003-2-1）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine Amino Transferase， ALT）（货号C009-2-1）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Amino Transferase， AST）（货号C010-2-1）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase， ALP）（货号A059-2-2）测定试剂盒购自南京建成生物技术研究所；色谱级甲醇（货号439193）购自德国Merck公司；β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide， NADH）（货号N814671）、碘硝基四唑紫（Iodine-nitro-tetrazolium Violet， INT）（货号I6069）、硫辛酰胺脱氢酶（货号D796312）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide， NAD）（货号N916067）、α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid， α-KG）（货号K812223）、3-（N-吗啉代）丙磺酸（3- （N-Morpholine） Propyl Sulfonic Acid，MOPS）（货号M812719）购自上海麦克林生化科技有限公司；5 × loading buffer 上样缓冲液（货号P0286）、RIPA裂解液（货号P0013B）、一抗二抗清除液（货号P0025）、pH 6.8（货号ST768）、pH 8.8（货号ST788）和 pH 7.5（货号ST775）的 Tris-HCl 缓冲液、N，N，N，N-四甲基乙二胺（N， N， N′， N′-Tetramethylethylenediamine， TEMED）（货号ST728）、过硫酸铵（Ammonium Persulfate， APS）（货号ST005）、30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（货号ST1751）和BCA 蛋白定量试剂盒（货号P0009）购自碧云天生物技术有限公司；苯甲基磺酰氯（Phenylmethylsulfonyl Fluoride Phenylmethylsulphonyl， PMSF）（货号3239503）购自北京百灵威科技有限公司；十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate， SDS）（货号S0002-250）和甘氨酸（货号G0011-500）购自南京生兴生物技术有限公司；Marker（货号MP102-01/02）和 ECL 高敏化学发光液（货号E423-01/02）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；兔抗 MAP2 多克隆抗体（货号ab183830）和兔抗突触素单克隆抗体（货号ab32127）购自英国 Abacm 公司；小鼠抗 β-actin 单克隆抗体（货号66009-1-Ig）购自美国Proteintech 公司；羊抗小鼠（货号91196）和羊抗兔（货号15295）二抗购自美国 Cell Signaling Technology 公司；PDH（货号A1895）和KGDH（货号A22163）单克隆抗体购自ABclonal 公司。实验用水为超纯水，其他试剂均为市售分析纯。

高效液相色谱仪：HPLC-RF系统（日本Shimadzu公司），包括CBM-20Alite控制系统、DGU-20A3R脱气机、SIL-20A自动进样器、LC-20AT送液泵、CTO-10Avp柱温箱、RF-10AXL荧光检测器及Shimadzu Labsolutions色谱工作站。Millipore-Advantage A10 超纯水器（美国 Millipore公司）；十万分之一精密天平、万分之一精密天平（德国 Sartotius BAS124S-CW）；Thermo Sorvall Stratos台式高速冷冻离心机、HERAFREEZE BASIC超低温冰箱（美国 Thermo Scientific 公司）；VORTEX-GENIE 2 涡旋混匀装置（美国 Scientific Industries 公司）；xw-80A 旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；T25 高速手持电动组织匀浆器（德国 JANKE&KUNKEL， IKA Labortechnik）；Beckman 超高速冷冻离心机（美国 Beckman 公司）；85-2 型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；Versa max 酶标仪（美国 MDC 公司）；HH-ZK2 恒温水浴（巩义市予华仪器有限公司）；BCD-321WDVI冰箱（青岛海尔集团）；Hera Freeze Basic超低温冰箱（美国 Thermo Scientific 公司）；T25 高速手持电动组织匀浆器（德国 JANKE&KUNKEL， IKA Labortechnik 公司）；Tanon-5200 Multi 全自动化学发光凝胶成像分析系统（中国天能科技公司）；电泳装置、湿转装置（美国 Bio-rad 公司）；FE28 pH 计（德国梅特勒-托利多仪器公司）；高架十字迷宫装置（上海吉量软件科技有限公司）。

1.2 建立BDL诱导的肝损伤大鼠模型

健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠，体质量200～220 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证编号为20180006037994。所有动物实验均经过中国药科大学动物伦理委员会批准（No.2022-06-002），动物给予自由饮水和标准饲料，在恒温（24±2 ℃）恒湿（55%±10%）的自然昼夜环境中适应性饲养7 d。

10只雄性Sprague-Dawley大鼠进行7 d的适应性饲养，当体质量达到250g以上时，即可进行胆管结扎手术。大鼠手术前禁食不禁水12 h，随机分为胆管游离不结扎的假手术组（Sham Operation， SHAM）和BDL组。大鼠经戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉后，腹部朝上固定头部和四肢，从剑突下一指位置消毒并脱毛。在剑突下一指处沿着腹白线向下开腹约1 cm，随后找到并游离肝脏到十二指肠段的胆总管，BDL组用尼龙线扎紧三处，SHAM组游离后不结扎，将十二指肠放回原位。向腹腔内滴入250 mg/mL的氨苄霉素后，缝合肌肉层和皮肤层。手术过程中所用的手术器械都经过消毒处理，缝合和结扎所用的针线都需要浸泡250 mg/mL的氨苄霉素。大鼠在术后饲养14 d，再进行后续实验。所有大鼠禁食不禁水12 h，用戊巴比妥钠（60 mg/kg ）麻醉后以股动脉放血的方式采血，将血液静置0.5 h 以上，用离心机 8000 r/min离心5 min 后取上清，得到血清（不含肝素钠）和血浆（含肝素钠）。取出大鼠脑组织，在冰上分离大脑皮层，并用于后续大脑皮层内物质的浓度测定。

1.3 建立硫胺素限制性饮食诱导的硫胺素缺乏大鼠模型

实验大鼠的来源、合格证编号和伦理批准号见“1.2建立BDL诱导的肝损伤大鼠模型”。10只雄性Sprague-Dawley大鼠进行7 d的适应性饲养后，随机分为饮食对照（Control， CON）组和硫胺素缺乏（Thiamine Deficiency， TD）组，并分别饲喂标准纯化饲料（硫胺素含量为5 mg/L）和硫胺素限制饲料（硫胺素含量≤0.01 mg/L）（江苏省特洛菲动物饲料高科技有限公司）。CON组的食物摄入量受到严格控制以匹配TD组的食物摄入量［15］。在喂养大鼠14 d后，再进行后续实验。所有大鼠禁食不禁水12 h，用戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉后以股动脉放血的方式采血，分别用含和不含肝素钠的15mL EP管收集血液，将血液静置0.5 h以上，用离心机8000 r/min离心5 min后取上清，得到血浆（含肝素钠）和血清（不含肝素钠）。取出大鼠脑组织，在冰上分离大脑皮层，并用于后续大脑皮层内物质的浓度测定。

1.4 测定大鼠血浆和脑皮层中硫胺素及其代谢物浓度

精密称取硫胺素、TMP和TPP标准品5 mg，加0.1 mol/L HCl溶解并用容量瓶定容至5 mL，得到1.0 mg/mL储备液。临用前用0.1 mol/L HCl 稀释为系列标准工作液。硫胺素的标准曲线工作液质量浓度为：4.9、9.8、19.5、39、78、156、312、625 ng/mL。TMP的标准曲线工作液质量浓度为：7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000 ng/mL。TPP的标准曲线工作液质量浓度为：19.5、39、78、156、312、625、1250、2500 ng/mL。上述所有的储备液和工作液都于4 ℃条件下避光保存。

血浆和脑样品的制备方法参考文献［16］，称取约100 mg大脑皮层组织样品于 2mL EP管中，加入250 μL超纯水，用手持电动组织匀浆器在冰水浴中进行匀浆，制得脑匀浆液。对硫胺素、TMP和TPP进行衍生化。衍生化试剂由7.7 mol/L NaOH 和 24.28 mmol/L 铁氰化钾按体积比1∶1混合制得，现用现配。取100 μL 血浆或100 μL 脑匀浆于1.5 mL EP管中，加入20 μL甲醇和50 μL衍生化试剂后混匀，再加入10 μL H3PO4调节样品pH为 7.0;振荡 10 min 后，以16000 r/min 在 4℃ 下离心 10 min，吸取120 μL 上清液到新的EP管中;再以16000 r/min 在 4℃ 下离心10 min，取100 μL 上清到进样瓶中进样。样品处理过程全程避光操作。

仪器：HPLC-RF系统（日本Shimadzu公司）；色谱柱为Kromasil 100-5C18（250×4.6 mm）E64682；流动相A相（水相）为含20 mmol/L CH3COONa的超纯水溶液，B相（有机相）为甲醇，有机相比例为33%，等度洗脱；流速为0.8 mL/min，样品检测时长为10 min；柱温为40 ℃；进样量为10 μL；检测器为RF-10AXL荧光检测器；检测波长为激发波长365 nm、发射波长435 nm；洗针液为50%甲醇-水溶液。

1.5 测定TPP依赖酶（PDH、KGDH和TK）活性

通过INT在500 nm 处的还原量来测定PDH的活性［17］。将大脑组织悬浮于pH 7.8 的 “样品缓冲液”（大脑组织 9 mL/g），其成分包含50 mmol/L K3PO4，1 mmol/L 2-巯基乙醇，1 mmol/L EDTA和0.1%（质量体积比）Triton X-100。用手持电动匀浆器将混合物均质化，获得大脑匀浆。最终的反应混合物总体积为200 μL，含有以下组分：50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L EDTA，0.2%（质量体积比）Triton X-100（pH 7.8），2.5 mmol/L NAD+，0.1 mmol/L辅酶A，1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L草酸，1 mg/mL牛血清白蛋白，0.6 mmol/L INT，5～7单位的硫辛酰胺脱氢酶，5 mmol/L丙酮酸，在阳性对照组中另加0.2 mmol/L TPP。在对照组和实验组中各加入10 μL 大脑匀浆（蛋白质质量浓度为3.6 g/L）启动反应，在37 ℃ 下反应 5 min 后测定500 nm 处的光学密度（Optical Density， OD），使用INT的还原量来表示PDH活性，每个组中的酶活性重复测定3次，取平均值。

通过在 340 nm 处NADH的生成量来表征KGDH的活性［15］。将大脑组织悬浮于pH为 7.8 的冰冷缓冲液中，缓冲液含有 50 mmol/L K3PO4和 0.2 mmol/L DTT。用手持电动匀浆器将混合物均质化，最终的反应混合物总体积为 200 μL，含有以下组分：50 mmol/L MOPS，50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L CaCl2，50 μmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，1 mmol/L α-KG，1 mmol/L NAD+，0.15 mmol/L 辅酶A，40 μmol/L 鱼藤酮，0.1%（质量体积比）Triton X-100，在阳性对照组中另加0.15 mmol/L TPP。最后，加入 10 μL 大脑匀浆（蛋白质质量浓度为5 g/L），使该体系在 30 ℃ 下反应 5 min，通过α-KG依赖的NADH生成量来表示KGDH的活性。酶标仪读取3次 340 nm 处OD值，取平均值。

TK活性的测定是按照Zhao等［18］的描述进行的。称取50 mg脑皮层于2 mL EP管中，加入250 μL 胞浆蛋白提取液，用手持电动匀浆器匀浆，以13000 r/min 4 ℃离心15 min 后，取上清液。总反应体系为200 μL，含有14.4 mmol/L核糖-5-磷酸，190 μmol/L NADH，380 μmol/L TPP，甘油磷酸脱氢酶>250 U/L，磷酸丙糖异构酶>6500 U/L，最后加入50 μL脑匀浆上清液启动反应，在340 nm处测量OD值，每隔5 min 测定1次，持续1 h。TK酶活性由15 min和45 min吸光度的差异值表示。每组酶活性测定重复3次，取平均值。

1.6 测定脑皮层中TPP依赖酶的蛋白表达

蛋白样本采用含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液从大脑皮层中提取。蛋白经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，被转移到偏二氟乙烯膜上。在含有0.1% Tween 20、5%脱脂牛奶的Tris缓冲液中室温孵育2 h，随后与相应的一抗抗体4 ℃ 孵育过夜，接着在室温下用二抗孵育2 h。免疫反应带浸泡在ECL发光液中进行可视化，并通过化学发光凝胶成像分析系统检测。

1.7 统计学分析

实验数据由Gradpad Prism 8.0 软件进行统计分析，绘制统计图。利用单因素方差分析进行组间比较，以P＜0.05 表示结果具有显著性差异。

2 结果

2.1 14天BDL诱导的大鼠肝损伤模型的建立

造模14天后处死BDL和SHAM大鼠，测定肝质量、脾质量和体质量，并利用相关试剂盒检测大鼠血清中肝功能相关的生理生化指标，来验证肝损伤模型是否建立成功。如表1所示，BDL大鼠在造模 14 天后与SHAM大鼠相比，体质量明显下降，并且肝质量体质量比和脾质量体质量比明显升高。BDL大鼠血清中AST、ALT、ALP活性比SHAM组显著升高。同时BDL大鼠血清中总胆红素、直接胆红素、总胆汁酸和血氨水平也显著升高。以上结果表明，14天BDL诱导的肝损伤大鼠模型建立成功。

2.2 BDL和TD大鼠血浆和脑皮层中硫胺素及其代谢物浓度

大鼠造模14天后处死，采集血浆和大脑皮层，进行硫胺素、TMP和TPP的浓度测定，结果如图1所示。与SHAM大鼠相比，BDL大鼠血浆中硫胺素和TMP水平出现了显著下降，而TPP水平无显著差异。在大脑皮层中，BDL大鼠的硫胺素水平显著降低，TMP和TPP水平相较SHAM大鼠无显著差异。

与CON大鼠相比，TD大鼠血浆中硫胺素和TMP水平出现了显著下降，而TPP水平无显著差异。在大脑皮层中，TD大鼠的硫胺素水平显著降低，TMP和TPP水平相比CON大鼠无显著差异。TD大鼠血浆硫胺素水平降低说明硫胺素缺乏大鼠模型建立成功。

A.BDL和SHAM大鼠血浆中硫胺素及其代谢物质量浓度；B.BDL和SHAM大鼠脑皮层中的硫胺素及其代谢物质量分数；C.TD和CON大鼠血浆中硫胺素及其代谢物质量浓度；D.TD和CON大鼠脑皮层中的硫胺素及其代谢物质量分数；注：TMP为单磷酸硫胺素；TPP为二磷酸硫胺素；CON为正常饮食组；TD为硫胺素限制饮食组；*为P<0.05，**为P<0.01。

2.3 BDL和TD大鼠脑皮层中TPP依赖酶的活性

大鼠造模14天后处死，取脑皮层样本，进行TPP依赖酶活性测定。结果如图2所示，与SHAM大鼠相比，BDL大鼠脑皮层中PDH、KGDH和TK活性均无显著变化。

与CON大鼠相比，在TD大鼠脑皮层中3种TPP依赖酶PDH、KGDH和TK的活性也没有显著改变。

2.4 BDL和TD大鼠脑皮层中TPP依赖酶的蛋白表达

大鼠造模14天后处死，取脑皮层样本，提取蛋白进行Western Blot实验。结果如图3所示，与SHAM大鼠相比，BDL大鼠脑皮层中PDH和KGDH的蛋白相对表达量无明显差异。

A.BDL和SHAM大鼠脑皮层PDH活性；B.BDL和SHAM大鼠脑皮层KGDH活性；C.BDL和SHAM大鼠脑皮层TK活性；D.TD和CON大鼠脑皮层PDH活性；E.TD和CON大鼠脑皮层KGDH活性；F.TD和CON大鼠脑皮层TK活性；注：PDH为丙酮酸脱氢酶；KGDH为α-酮戊二酸脱氢酶；TK为转酮醇酶。

与CON大鼠相比，TD大鼠脑皮层中PDH和KGDH的蛋白相对表达量也无明显差异。

3 结论

本文旨在研究14天BDL诱导的肝损伤对大鼠硫胺素及其代谢物水平的影响。采用国际上常用的BDL诱导的肝损伤模型［19］，通过相关试剂盒测定发现BDL大鼠血清中的氨、总胆红素、直接胆红素、总胆汁酸的水平升高，且ALT、AST、ALP的活性升高，同时BDL大鼠的肝质量体质量比和脾质量体质量比也升高，实验过程中肉眼可见肝脾肿大，这些结果表明BDL诱导的肝损伤大鼠模型构建成功。

硫胺素的吸收和转运主要通过OCTs和THTRs等转运体介导［20］。OCT2和OCT3的抑制剂皮质醇可以显著降低硫胺素的肠吸收，使硫胺素的肠通透系数（Effective Permeability，Peff）降低至对照组的30%左右，说明OCTs参与硫胺素的肠吸收［21］。OCT1主要表达在肝细胞窦侧膜上，将硫胺素从血液侧转运至肝内，而OCT2主要表达在肾小管细胞基底侧膜，将硫胺素从血液侧转运至肾小管细胞，随即由刷状缘膜上的MATEs外排至尿液［20，22］。Denk等［23］发现BDL大鼠肝脏中OCT1 的mRNA和蛋白表达水平降低，并伴随着OCT1介导的摄取功能降低。Hong等［21］发现14天BDL诱导的肝损伤会导致大鼠各肠段中OCT2蛋白表达水平降低，肾脏OCT2的mRNA和蛋白表达水平升高，与此相对应的是，硫胺素的肠吸收减少和尿排泄增加，血硫胺素的浓度显著降低。因此，14天BDL诱导的肝损伤会导致外周器官中硫胺素转运体的蛋白表达水平降低，使大鼠的血硫胺素水平降低，而血硫胺素水平下降可能是肝损伤大鼠脑皮层中硫胺素水平降低的主要原因之一。

基于以上结果，原先推测BDL诱导的肝损伤也会降低脑内硫胺素代谢物TPP水平，导致TPP依赖酶活性下降，阻碍正常的糖代谢途径［24］。然而，BDL大鼠脑皮层中TPP浓度及其依赖酶PDH、KGDH和  A.BDL和SHAM大鼠脑皮层中PDH的蛋白相对表达量；B. BDL和SHAM大鼠脑皮层中KGDH的蛋白相对表达量；C.TD和CON大鼠脑皮层中PDH的蛋白相对表达量；D. TD和CON大鼠脑皮层中KGDH的蛋白相对表达量。

TK的活性并没有发生显著变化，PDH和KGDH蛋白的相对表达量也没有改变，这些发现并不符合先前的推测，表明14天BDL诱导的肝损伤仅降低大鼠血浆和脑皮层中硫胺素水平，但不影响其代谢物TPP浓度及其依赖酶活性与表达。这可能与造模时间有较大关系，文献报道28天BDL诱导的肝损伤大鼠皮层和海马中ATP与ADP 比值、糖摄取和CO2生成等能量代谢指标显著低于对照鼠［25］，提示在28天BDL大鼠皮层和海马中硫胺素及其代谢物TPP浓度以及TPP依赖酶的活性均是降低的，进而影响脑能量代谢。

以硫胺素限制饮食构建的TD大鼠模型进行对比研究。在TD大鼠造模后期，观察到硫胺素缺乏造成的厌食［26］、烦躁［27］和翻正反射消失［15］等症状。造模结束后检测TD大鼠的血浆和脑皮层样品，发现硫胺素水平降低，说明硫胺素缺乏大鼠模型构建成功。在硫胺素缺乏大鼠中同样观察到血浆和脑皮层中硫胺素水平显著降低，但TPP浓度及其依赖酶活性与表达均未发生显著改变。这同样与造模时间有较大关系，文献报道，在硫胺素限制饮食缺乏28天后大鼠脑内TPP的浓度降低约30%［28］，而14天的硫胺素限制饮食并不影响大鼠脑内TPP的浓度及其依赖酶的活性与表达。

此外还有文献报道，硫胺素在神经系统中起着酶促和非酶促的作用［29］。尽管TPP依赖酶的活性降低被认为是造成硫胺素缺乏症状的主要原因，但硫胺素本身也同时发挥着非酶促作用，作为轴质、线粒体和突触体膜的活性成分参与神经元的突触形成、轴突生长和髓鞘生成［30］。因此，硫胺素缺乏同样可能阻碍上述过程，影响神经元的正常功能，并导致认知缺陷等中枢神经功能障碍。此外，硫胺素缺乏对各脑区的影响具有选择性［6］。Butterworth等［15］发现，硫胺素缺乏会导致KGDH的活性在中脑、脑干和下橄榄核中的活性明显降低，TK在下丘脑中的活性显著降低［31］，而PDH的活性在所有脑区中均无显著改变［15］。值得注意的是，在大脑皮层中并没有发现PDH、KGDH和TK活性降低，这与在TD大鼠中观察到的现象一致，表明以大脑皮层作为研究对象具有局限性。上述研究均提示，在硫胺素缺乏状态下，脑皮层中PDH、KGDH和TK酶活性的降低不是影响神经系统的唯一途径，硫胺素的非酶促作用以及其他脑区受到的影响也需要纳入考虑。

综上所述，14天胆管结扎诱导的肝损伤和硫胺素限制饮食均会显著降低大鼠血浆和脑硫胺素水平，但不影响其代谢物TPP浓度及其依赖酶的活性和表达。

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（编辑 李春燕）

Effect of liver injury on the levels of thiamine and its metabolites in rats

YE  Qianli1， ZHANG  Jiayi2， LIU  Li1*

（1.School of Pharmacy， China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China;

2.Department of Basic Medicine and Forensic Medicine， Baotou Medical College， Baotou 014000， China）

Abstract：  To investigate the effects of liver injury on the levels of thiamine and its metabolites in rats，14-day bile duct ligation and thiamine-restricted diet were used to construct liver injury and thiamine-deficient rat models， respectively. After successful modeling， the concentrations of thiamine and its metabolites in plasma and cerebral cortex were measured， and the activity of thiamine pyrophosphate-dependent enzymes and protein expression levels in cerebral cortex were further analyzed. 14-day bile duct ligation induced liver injury in rats and thiamine-deficient rats resulted in a significant decrease in the concentration of thiamine in the plasma and cerebral cortex， but the concentration of its metabolite， thiamine pyrophosphate， remained unchanged. The activity of thiamine pyrophosphate-dependent enzymes and protein expression in the cerebral cortex also did not change. 14-day bile duct ligation induced liver injury and thiamine-restricted diet significantly reduced plasma and brain thiamine levels in rats， but did not affect the concentration of its metabolite thiamine pyrophosphate as well as its dependent enzyme activity and expression.

Key words： bile duct ligation; liver injury; thiamine; thiamine pyrophosphate

基金项目：国家自然科学基金；项目编号：82173844。

作者简介：叶倩利（1999—），女，硕士研究生；研究方向：药物代谢动力学。

*通信作者：刘李（1981— ），男，教授，博士；研究方向：药物代谢动力学。