36株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药表型和基因型特征分析

易雪丽 陈晓颖 滕元姬 罗斌

【摘要】目的分析广西百色市某三级甲等医院2020—2022年分离自临床的36株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CRKP）的耐药性及耐药机制，为医院感染防控和指导临床治疗提供依据。

方法使用微量肉汤稀释法及纸片扩散法检测分离的36株CRKP对临床常用抗生素及头孢他啶/阿维巴坦的耐药性，同时使用聚合酶链式反应检测常见耐药基因携带情况，并使用碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测菌株携带的碳青霉烯酶种类。

结果36株CRKP对除头孢他啶/阿维巴坦之外的所有β内酰胺类药物和氟喹诺酮类药物耐药率均超过90%，对头孢他啶/阿维巴坦耐药率为33.3%，对阿米卡星的耐药率为63.9%，对磺胺类药物复方新诺明耐药率为61.1%。blaKPC携带率为63.89%，blaNDM携带率为19.44%，blaTEM携带率为75.00%，blaCTX-m携带率为16.67%，blaSHV携带率为91.67%，blaAmpc携带率为5.56%，未检出携带blaOXA-48的菌株。表型检测显示有34株菌产碳青霉烯酶，其中23株单产A类酶，10株单产B类酶，1株同时产A类酶和B类酶。

结论通过对常见CRKP耐药性及基因表型进行调查可以为临床抗生素的合理应用和感染的防控提供科学依据。

【关键词】肺炎克雷伯菌；耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；头孢他啶/阿维巴坦

中图分类号：R378.99+6文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.05.004

Analysisondrugresistancephenotypeandgenotypecharacteristicsof36carbapenemresistantKlebsiellapneumoniaestrains

YIXueli，CHENXiaoying，TENGYuanji，LUOBin

（CenterforMedicalLaboratoryScience，theAffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities，Baise533000，Guangxi，China）

【Abstract】ObjectiveToanalyzethedrugresistanceanddrugresistancemechanismof36strainsofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae（CRKP）isolatedinanationalcomprehensivethreeA-levelhospitalfrom2020to2022inBaise，Guangxi，soastoprovidebasisforhospitalinfectionpreventionandcontrolandtheguidanceofclinicaltreatment.

MethodsTheresistanceof36strainsofCRKPtocommonclinicalantibioticsandceftazidime/avertamwasdetectedbybrothmicrodilutionmethodandKirby-Bauermethod.Atthesametime，polymerasechainreactionwasusedtodetectthecarryingofcommondrugresistancegenes.Carbapenemenzymeinhibitorenhancementtestwasusedtodetectthetypesofcarbapenemenzymescarriedbythestrains.

Results36CRKPshowedover90%resistancetoallβlactaamsandfluoroquinolonesexceptceftazidime/avibactam，33.3%resistancetoceftazidime/avibactam，63.9%resistancetoamikacin，and61.1%resistancetosulfacotrimoxazole.ThecarryingrateofblaKPC，blaNDM，blaTEM，blaCTX-m，blaSHV，andblaAmpcwas63.89%，19.44%，75.00%，16.67%，91.67%，and5.56%，respectively.NostraincarryingblaOXA-48wasdetected.Phenotypicdetectionshowedthat34strainsproducedcarbapenem，ofwhich23strainsproducedclassAenzymes，10strainsproducedclassBenzymes，and1strainproducedbothclassAandBenzymes.

ConclusionInvestigationofcommonCRKPresistanceandgenephenotypescanprovideascientificbasisfortherationalapplicationofclinicalantibioticsandthepreventionandcontrolofinfection.

【Keywords】Klebsiellapneumoniae;carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae（CRKP）;carbapenem;ceftazidime/avibactam

肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae，KP）是肠杆菌目革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界及人体内，通常属于条件致病菌，可引起呼吸道感染、泌尿道感染、肝脓肿和血流感染等多种机会感染。全国细菌耐药监测网和中国CHINET监测网的统计结果显示，KP在临床分离的革兰阴性杆菌中排第二位，同时随着碳青霉烯类药物在临床的广泛应用，KP对该类药物的耐药性逐年上升［1-2］。2005至2021年，中国CHINET监测网数据显示耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP）的检出率从3%上升至23%以上［3］。而全国细菌耐药监测网数据也显示2019年CRKP的检出率已经上升至10.9%［4］。CRKP除了对碳青霉烯类药物耐药之外，还常常同时携带多种耐药基因，对大部分临床常用抗生素都显示为耐药，致使临床常常面临着无药可用的困境。特别是由CRKP引起的医院感染暴发时，更是给临床治疗带来了极大的困难。因此，本研究拟对本院分离的CRKP菌株的耐药性和基因型特征进行分析，探讨CRKP对临床常用抗生素的耐药性以及常见耐药机制，以求为临床抗感染治疗和医院感染防控提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

收集2020年4月—2022年8月右江民族医学院附属医院住院患者临床分离的CRKP菌株，剔除同一患者分离自相同部位的重复菌株。菌株入选标准：①菌株鉴定结果为KP；②药敏结果符合美国临床和实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）M100-S31中的判定标准，即对亚胺培南、美罗培南或厄他培南其中一种碳青霉烯类药物耐药的CRKP菌株。

1.1.2仪器与试剂

细菌鉴定使用法国梅里埃VITEKMS质谱仪及其配套的VITEKMS-CHCA基质，微量肉汤稀释法使用法国梅里埃VITEK2-COMPACT全自动微生物分析仪及其配套的AST-GN334药敏卡片，纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B）使用的药敏纸片及M-H培养基购自英国OXOID生物公司，PCR仪、电泳仪及凝胶成像设备购自美国伯乐公司，PCR扩增试剂购自宝生物工程（大连）有限公司，碳青霉烯酶缓冲液购自珠海迪尔生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1细菌分离鉴定及常规药敏试验

按照《全国临床检验操作规程（第4版）》要求进行细菌分离培养；使用法国梅里埃VITEKMS对分离菌株进行鉴定；使用法国梅里埃VITEK2-COMPACT及AST-GN334药敏卡片进行常规药敏试验，头孢他啶/阿维巴坦使用纸片扩散法进行药敏试验，药敏结果判断参照CLSIM100-S31进行判读。对仪器检测出来的CRKP菌株使用英国OXOID的厄他培南、亚胺培南和美罗培南药敏纸片进行复核，复核后置于-80℃超低温冰箱保存。使用大肠埃希菌ATCC8739、铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株，菌株为本实验室保存质控菌株。

1.2.2常见耐药基因检测

菌株从冰箱复苏到血平板后，置于35℃大气环境培养16～18h后，挑取单个菌落使用煮沸法提取细菌DNA。参考文献合成blaKPC、blaNDM、blaOXA-48、blaAmpc、blaCTX-m、blaTEM和blaSHV引物，引物相关序列及退火温度见表1［5-9］。使用宝生物工程（大连）有限公司的PCR扩增试剂进行扩增，采用50μL的反应体系，扩增条件：98℃变性10s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环。经琼脂糖凝胶电泳后每个基因取一个阳性扩增产物送至广州艾基生物有限公司测序，测序结果在GenBank中经BLAST比对分析，确定为目的基因后作为阳性对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像后与阳性对照进行比对，所出现条带与阳性对照大小相同者为阳性结果。

1.2.3碳青霉烯酶表型检测

参照《肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识（第二版）》，进行A类丝氨酸碳青霉烯酶和B类金属β内酰胺酶检测［10］。

2结果

2.1细菌分离鉴定及常规药敏试验

2020年4月—2022年8月从右江民族医学院附属医院住院患者临床样本中共分离出36株非重复的CRKP菌株，使用法国梅里埃VITEKMS质谱仪进行鉴定，结果显示所有菌株均为肺炎克雷伯菌，鉴定符合率均在95%以上。36株CRKP对阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁和厄他培南耐药率均为100%，对其他β内酰胺类药物哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南和美罗培南耐药率也均在90%以上，对阿米卡星的耐药率为63.9%，对左旋氧氟沙星耐药率为97.2%，对复方新诺明耐药率为61.1%，对头孢他啶/阿维巴坦耐药率为33.3%。见表2。

2.2常见耐药基因携带情况

36株CRKP中，常见碳青霉烯酶基因检测显示以携带blaKPC为主，共有23株，携带率为63.89%；有7株携带blaNDM，携带率为19.44%；未检出携带blaOXA-48的菌株。常见超广谱β内酰胺酶基因检测显示有27株携带blaTEM基因，携带率为75.00%；有6株携带blaCTX-m，携带率为16.67%，有33株携带blaSHV，携带率为91.67%。此外有2株携带blaAmpc基因，携带率为5.56%。C9及D1菌株耐药基因PCR产物电泳图见图1。

2.3碳青霉烯酶表型检测

36株CRKP中，23株单产A类酶，10株单产B类酶，1株同时产A类酶和B类酶，2株既不产A类酶也不产B类酶。部分菌株碳青霉烯酶抑制剂增强试验阳性结果见图2。菌株常见耐药基因及碳青霉烯酶表型检测结果见表3。

3讨论

CRKP最主要的耐药机制是产碳青霉烯酶，除了产碳青霉烯酶之外，有少部分菌株的耐药机制是产生超广谱β内酰胺酶和/或Ampc酶合并外膜孔蛋白表达下调或者缺失。Ambler分类将碳青霉烯酶分为A类、B类和D类三大类，A类为丝氨酸蛋白酶，以KPC酶最为常见；B类为金属酶，以NDM酶最为常见；D类主要以OXA-48酶最为常见。由于耐药菌株编码碳青霉烯酶的耐药基因通常在质粒上，而且质粒常常还同时携带有对其他抗菌药物耐药的基因，因而常表现出广泛耐药甚至是全耐药的特征，并容易在不同菌株及菌种之间传播，可引起院内暴发感染，致使临床的抗感染治疗面临着无药可用的困境［11-12］。本研究显示，36株分离株对除头孢他啶/阿维巴坦之外的所有β内酰胺类药物和氟喹诺酮类药物耐药率均超过90%，对阿米卡星的耐药率为63.9%，对磺胺类药物复方新诺明耐药率为61.1%，这一结果与国内其他报道相符［13-15］。

头孢他啶/阿维巴坦是由头孢他啶和阿维巴坦组成的新型抗生素，其对碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistantenterobacterales，CRE）具有较好的抗菌活性，我国2019年9月批准可以使用其治疗CRE感染。然而头孢他啶/阿维巴坦对A类酶和部分D类酶有抗菌活性，对B类金属酶无抗菌活性，因此针对产生不同型别碳青霉烯酶的CRE菌株，用药治疗方案会有差异，明确CRE的耐药机制有利于指导治疗方案的制订［16］。自2015年FDA批准临床使用头孢他啶/阿维巴坦治疗CRE以来，关于产生耐头孢他啶/阿维巴坦的CRE菌株的报道越来越多，在我国也陆续有相关报道，尤其是耐头孢他啶/阿维巴坦的KP。目前我国大部分实验室不常规进行头孢他啶/阿维巴坦的药敏试验，因此缺乏CRE对头孢他啶/阿维巴坦耐药性的相关流行病学数据，临床主要以经验治疗为主。随着越来越多的耐药突变体的出现，经验治疗失败的概率也在不断增加，因此针对头孢他啶/阿维巴坦进行常规药敏试验有助于减少经验治疗失败的可能。本研究中有12株CRKP显示对头孢他啶/阿维巴坦产生耐药性，除了编号为D1的菌株之外，其余头孢他啶/阿维巴坦耐药菌株均产B类金属酶。KP对头孢他啶/阿维巴坦的耐药机制主要有三种：①产生B类金属酶；②KPC酶的表达增加与膜孔蛋白突变；③blaKPC基因关键位点发生突变［17］。2022年复旦大学附属华山医院在《柳叶刀》报道了1例使用头孢他啶/阿维巴坦治疗后，一株KP的blaKPC-2基因发生突变进化为blaKPC-76，进而引起头孢他啶/阿维巴坦耐药，导致治疗失败的病例［18］。自2020年以来，blaKPC基因突变体的数量迅速增加。到目前为止，GenBank数据库中登记有145个blaKPC突变体，所有这些突变体都是blaKPC-2和blaKPC-3的突变，关于这些突变体的报告主要来自美国和中国［19］。D1菌株检测结果显示同时携带blaKPC、blaAmpc、blaTEM和blaSHV四个耐药基因，不排除可能为blaKPC产生突变引起的耐药，其具体耐药机制有待后续进一步探讨。

不同国家和地区流行的CRE菌株产生的碳青霉烯酶型别均有差异，CHINET中国细菌耐药监测网对2018年收集自全国的935株CRE研究结果显示，产KPC酶、NDM酶和OXA-48型碳青霉烯酶菌株所占比例分别为51.6%、35.7%和7.3%，其中有少数菌株产生多种碳青霉烯酶。而在美国，则以产NDM酶最为常见，OXA-48较少［10］。本研究显示，本院分离的CRKP以产KPC酶为主，占比为63.89%，NDM酶次之，占比为19.44%，未检出产OXA-48的菌株。这一结果与CHINET中国细菌耐药监测网调查结果相似。除了地域区别之外，儿童和成人分离菌株的碳青霉烯酶携带型别也有差异，NDM酶主要见于从儿童患者中分离的CRE，而从成人患者中分离的CRE则主要是以产KPC酶为主［20］。本研究收集的菌株均来自成人患者，因此无法比较不同人群间的差异。除了碳青霉烯酶耐药基因之外，我们还检测到了几个常见的超广谱β内酰胺酶基因和Ampc酶基因，结果显示大部分菌株都同时携带有超广谱β内酰胺酶基因，以blaSHV携带率最高，其次是blaTEM，较少菌株携带有blaCTX-m。而blaAmpc基因携带率较低，仅有2株检出。当菌株同时产生超广谱β内酰胺酶和碳青霉烯酶时，由于碳青霉烯酶会影响超广谱β内酰胺酶表型检测的结果，因此在发放临床报告的时候应注意避免发放假阴性的超广谱β内酰胺酶表型检测结果。

目前，细菌耐药已经成为全球公共卫生问题，尤其是近几年CRKP的高发病率及高致死率，因此对本地区常见CRKP耐药性和基因表型进行调查可以为临床抗生素的合理应用和感染的防控提供科学依据。

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