高效液相色谱法在茶叶有机酸检测中的应用研究进展

2024-06-19胡燕

中国茶叶 2024年6期

基金项目：2021年度雅安市高层次人才科研项目（科技创新创业苗子工程重点项目）资助

作者简介：胡燕，女，高级工程师，主要从事茶叶资源开发与利用及茶叶检测研究工作，E-mail：xiaowei401@sohu.com

摘要：茶叶中的有机酸是影响茶叶香气和滋味的主要成分之一，高效液相色谱法是食品中有机酸检测的常用方法，具有操作简单、灵敏度高、分离效果好等特点。文章综述了有机酸对茶叶风味品质的影响、高效液相色谱法目前能测定出的茶叶中有机酸种类以及采用高效液相色谱法测定茶叶中有机酸的研究进展，总结了测定茶叶中有机酸的高效液相色谱条件，包括检测波长、流动相、柱温和流速等，并对采用高效液相色谱法测定茶叶中有机酸存在的困难及该方法的应用前景进行了展望，以期促进茶叶中有机酸检测技术的发展，为茶叶的品质特征及保健功效研究提供指导，为茶叶中有机酸组分检测方法标准的制定提供参考。

关键词：高效液相色谱法；茶叶；有机酸；应用

中图分类号：TS272.7；O657.72 文献标识码：A 文章编号：1000－3150（2024）06-11-7

Progress in the Application of High Performance Liquid

Chromatography in the Detection of Organic Acids in Tea

HU Yan

Ya'an Quality Inspection and Testing Institute （Ya'an Institute for Food and Drug Control）/National Tea Product

Quality Inspection and Testing Center （Sichuan）， Ya'an 625000， China

Abstract： Organic acids are the main components affecting tea aroma and taste. High performance liquid chromatography is a commonly used method for detecting organic acids in food， which has the characteristics of simple operation， high sensitivity， and good separation effect. The article reviewed the effects of organic acids on the flavor and quality of tea， the types of organic acids that could be determined in tea using high-performance liquid chromatography， as well as relative research progress. It summarized the conditions for determining organic acids in tea using high performance liquid chromatography， including the selection of detection wavelength， mobile phase， flow rate， and column temperature. The difficulties in using high performance liquid chromatography to determine organic acids in tea and the application prospects of the method were discussed， in order to promote the development of organic acid detection technology in tea. This paper provided guidance for the study of quality characteristics and health benefits of tea， and provided a reference for the formulation of detection method standards for organic acid components in tea.

Keywords： high performance liquid chromatography， tea， organic acid， application

有机酸是茶叶中的主要活性成分之一，主要功能键为羧基（-COOH），具有软化血管，促进人体对钙、铁等元素的吸收和对蛋白质、淀粉的消化等功能[1-2]，可通过改善肠道微环境的pH来调节肠道免疫力，抑制致病菌的生长繁殖[3-5]。茶叶中有机酸的含量约为干物质总量的3%[6]，其种类和含量与茶树品种、茶叶嫩度、产地、加工工艺、储藏条件等有关[7]。有机酸影响着茶树体内的物质形成与转化，参与茶树的新陈代谢，是茶叶中一些滋味成分和香气成分的前体或中间产物，影响着茶叶品质的形成，但迄今为止对茶叶中有机酸组分及含量、茶叶加工过程中有机酸的变化规律等方面还缺乏系统研究。

茶叶中有机酸的测定方法主要有电位滴定法、毛细管电泳法、离子色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法等[8]。电位滴定法是利用电位的变化来确定滴定终点，适用于对茶叶中总有机酸进行测定；毛细管电泳法以石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的差异来实现分离，具有操作简单、高效快速、试剂与样品消耗少等优点，但重现性较差；离子色谱法对样品的净化要求高，对于成分复杂的茶叶样品的分析难度较大，且当样品中有大量无机阴离子与有机酸同时存在时，对低分子量有机酸的检测难度会增加；气相色谱法适用于测定低分子量的有机酸，对于挥发性较低的有机酸需要进行衍生化处理，操作繁琐；气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法具有色谱的高分离度和质谱的高灵敏度，准确性高、特异性好，但仪器昂贵；高效液相色谱法具有操作简单、灵敏度高、分离效果好等特点，更适合对复杂基质中的有机酸进行测定，是目前最广泛使用的有机酸测定方法[9]。

本文综述有机酸对茶叶风味品质的影响和适用于高效液相色谱测定的茶叶中主要有机酸组分，总结采用高效液相色谱法测定茶叶中有机酸组分及含量的研究进展，分析测定茶叶中有机酸的高效液相色谱条件，展望今后的研究方向，以期为深入研究茶叶中有机酸的组成及含量奠定理论基础，为茶叶品质风味及保健功效的研究提供参考。

1 有机酸对茶叶风味品质的影响

茶叶作为一种风味饮料，其品质优劣取决于风味品质成分的组成，风味品质成分包括香气成分和滋味成分，有机酸种类与含量的变化会对茶叶的香气和滋味产生不同程度的影响，其中芳香族有机酸主要影响茶叶的香气，而脂肪族有机酸是茶叶中重要的滋味成分，主要包括二元羧酸和羟基多元羧酸，如琥珀酸、苹果酸、柠檬酸等，以及环状结构的脂肪酸，如奎尼酸等[10]。谢娇枚等[11]的研究表明，祁门红茶在存放过程中，酸类物质如草酸、乙酸等的含量随存放时间延长呈增加趋势，而柠檬酸含量的下降对其茶汤滋味品质的影响较大。琥珀酸等有机酸本身无味，但与谷氨酸结合后，对茶汤中的鲜味具有重要贡献[8]。有机酸参与了茶叶香气的形成与转化，其中脂肪酸是影响茶叶香气组分形成的重要成分之一，这是因为某些脂肪酸自身就具有一定的香气，是构成茶叶香气的组分之一，而且茶叶中的亚麻酸、亚油酸等可通过氧化反应转变为己烯醇等芳香物质[12]。

2 茶叶中可采用高效液相色谱法测定的主要有机酸组分

茶叶中现已发现的有机酸有40余种，其中香气成分有30余种[13]，可用高效液相色谱法测定的茶汤中的有机酸组分主要有10余种，包括抗坏血酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、乳酸、水杨酸、草酸、富马酸、马来酸、奎尼酸等，其化学结构式见图1。茶叶中有机酸的高效液相色谱分析色谱图见图2[7]。抗坏血酸是一种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，由于具有烯二醇结构，化学性质不稳定，容易被氧化，因此具有很强的还原性[14]，具有清除自由基的能力，能够阻止自由基的损害，延缓衰老[15]。乙酸中的乙酰基如果与辅酶A结合就可成为碳水化合物和脂肪新陈代谢的中心。酒石酸的酸味强烈；苹果酸的酸味爽口、略带刺激性，有略微的苦涩感；柠檬酸呈现出一种清新的酸味；琥珀酸除酸味外还有咸苦味。苹果酸、琥珀酸和柠檬酸均参与了三羧酸循环，苹果酸在苹果酸脱氢酶的作用下合成草酰乙酸，草酰乙酸在柠檬酸合酶的作用下合成柠檬酸；琥珀酸是三羧酸循环的中间产物，可由柠檬酸先生成α-酮戊二酸，进而合成琥珀酸[16]；柠檬酸在顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和琥珀酸-CoA合成酶的作用下也可合成琥珀酸；苹果酸可由琥珀酸在琥珀酸脱氢酶和富马酸酶的作用下合成。丙酮酸是糖、脂肪和蛋白质代谢的中间产物，是重要的生物活性中间体[17]。相关研究表明，经微生物发酵的茶叶中有机酸含量大于非发酵茶[4]，例如根霉可分泌凝乳酶使脂类物质汇集生成乳酸，从而使茶汤顺滑甘醇[18]。水杨酸是重要的调控植物免疫反应的植物激素之一，具有清热、解毒和杀菌等作用。草酸能使多酚氧化酶的活性降低，可作为天然抗氧化剂使用[15]；富马酸即反丁烯二酸，酸味很强，并具有涩味，与马来酸（顺丁烯二酸）互为顺反异构体，马来酸经催化氢化或化学还原可生成琥珀酸。茶鲜叶在揉捻、渥堆等过程中，脱氢奎尼酸在奎尼酸脱氢酶的催化作用下可产生奎尼酸，导致奎尼酸含量上升[19]。

3 高效液相色谱法测定茶叶中有机酸的研究进展

茶叶依据其产品特质、加工工艺及在加工过程中的“发酵程度”分为绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶和黑茶六大类，不同茶类的主要有机酸组成及其含量有所差异，具体见表1[6，20-27]。由于茶叶的内含成分复杂，目前采用高效液相色谱法对茶叶中有机酸进行研究还处于起步阶段，主要集中于对白茶和黑茶中的有机酸组分和含量进行测定，对其他茶类中有机酸的研究较少。

3.1 绿茶中有机酸的测定

绿茶是我国产量最大的茶类，由茶鲜叶经杀青、揉捻、干燥等工艺制作而成。陆敏等[28]运用高效液相色谱法测定了绿茶中柠檬酸、苹果酸、草酸、酒石酸、丁二酸、乳酸等有机酸的含量。刘爽等[29]对名优绿茶与大宗绿茶中有机酸的研究表明，抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸等的含量会随着绿茶品质的下降而下降，名优绿茶的有机酸总量高于大宗绿茶。刘盼盼等[20]测定了不同茶树品种、不同叶位的鲜叶原料加工的烘青绿茶的有机酸含量，结果表明在有机酸组成中奎尼酸、苹果酸、柠檬酸和草酸的含量较高，随着鲜叶嫩度的下降，草酸的含量下降明显，不同茶叶品种对有机酸含量有较大影响。

3.2 白茶中有机酸的测定

白茶属于微发酵茶，不炒不揉，成茶具有外形满身披毫，毫香清鲜，汤色黄绿清澈，滋味清淡回甘的品质特点[30]。Marat等[31]采用高效液相色谱法分析了白茶加工过程中有机酸组分的含量，结果表明白茶中的有机酸组分主要有柠檬酸、草酸、水杨酸、抗坏血酸等，其中柠檬酸的含量最高，白茶加工过程中总有机酸含量呈递增趋势。何水平[15]建立了测定白茶中有机酸的高效液相色谱分析方法，测定了白茶中的草酸、乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸和富马酸含量，结果表明乙酸是所测白茶样品中的主要有机酸，乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸含量随鲜叶等级的降低而下降，苹果酸的含量则随着鲜叶等级的降低而增加。吕海鹏等[30]的研究表明，白茶茶汤中的有机酸组分以奎尼酸、草酸和酒石酸为主。田宇倩等[7]采用高效液相色谱法分析了不同嫩度白茶及其萎凋过程中的草酸、酒石酸、奎尼酸、丙酮酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸等9种有机酸的含量，结果表明白牡丹的有机酸含量最高，寿眉的有机酸含量最低，柠檬酸、奎尼酸是影响有机酸总量变化的主要组分。

3.3 黄茶中有机酸的测定

黄茶属于轻发酵茶，独特的“闷黄”工艺使黄茶具有“黄汤黄叶、味甘鲜爽”的品质特征[32]。谢关华[10]采用高效液相色谱法对梅占品种加工而成的六大茶类的有机酸组分进行了测定，结果表明黄茶的有机酸总量最高，黄茶中含量最高的有机酸为乙酸，草酸、酒石酸、苹果酸含量较高。

3.4 乌龙茶中有机酸的测定

乌龙茶属于部分发酵的茶类，经过萎凋、摇青与凉青、杀青、揉捻、干燥等主要加工工艺制成[33]。刘盼盼等[20]对红茶、乌龙茶、绿茶和普洱茶中有机酸的研究表明，不同茶类间有机酸含量的差异较大，其中乌龙茶中含量较高的有机酸为柠檬酸、奎尼酸和抗坏血酸。莫润明等[21]采用高效液相色谱法研究了铁观音陈化过程中10种有机酸组分的变化规律，结果表明乳酸和琥珀酸是陈化过程中的主要有机酸。王丽丽等[6]对清香型铁观音的研究表明，含量最高的有机酸是乳酸，其次为草酸和乙酸，在所测茶样中未检出琥珀酸。

3.5 红茶中有机酸的测定

红茶属于全发酵茶，由茶鲜叶经过萎凋、揉捻、发酵和干燥等一系列加工工艺制作而成[34]。红茶经过萎凋、揉捻、发酵等加工工序后，有机酸含量呈增长趋势，如草酸、琥珀酸、苹果酸等有机酸含量增加较为明显，直至干燥时才有所降低[15]。宋楚君等[35]采用高效液相色谱法测定了大叶种红茶中的有机酸，结果表明富马酸和柠檬酸的含量较高。张静等[22]测定了红茶中的草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙酮酸和抗坏血酸等有机酸的含量，结果表明所测红茶中的有机酸以草酸为主，乳酸和乙酸的含量在不同产地红茶中的差异较大。谢子譞[36]采用高效液相色谱法从工夫红茶中鉴定出13种有机酸，结果表明提香工艺能够显著影响工夫红茶贮藏过程中有机酸含量的变化，推测草酸、苹果酸和奎尼酸含量的增加可能是提香茶叶贮藏过程中滋味酸化的重要原因。

3.6 黑茶中有机酸的测定

茶叶中有机酸的种类和含量与茶叶发酵程度有关，一般发酵程度越重，有机酸含量越高。黑茶属于后发酵茶，制茶工艺一般包括杀青、揉捻、渥堆和干燥4道主要工序，其渥堆工序中微生物代谢可产生大量的有机酸，同时，各种物化动力使茶叶在渥堆时新陈代谢加快，而有机酸作为糖、脂等多种物质代谢的中间产物，其含量会随代谢加快而上升[37]。袁玲等[38]利用高效液相色谱法测定了茯砖茶样品中的草酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、乳酸、乙酸的含量。丁玲等[23]利用高效液相色谱法测定了紧压茶中的草酸、α-酮戊二酸、苹果酸、抗坏血酸等10种有机酸。谌滢[18]对不同年份六堡茶、茯砖茶、千两茶、普洱熟茶中的有机酸组分及含量进行了分析，结果表明茶样中草酸的含量较高，茯砖茶、千两茶中含有较多的乳酸和柠檬酸，六堡茶、普洱熟茶中含有较多的苹果酸。吕海鹏等[24]的研究表明，普洱茶中的有机酸成分以草酸、苹果酸等为主。舒娜[39]测定了六堡茶中7种有机酸组分，其中含量最高的是草酸，而后为乙酸、琥珀酸、奎尼酸，仅在部分茶样中检出了柠檬酸。

4 测定茶叶中有机酸的高效液相色谱条件

目前采用高效液相色谱法测定茶叶中的有机酸主要集中在奎尼酸、乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、富马酸、马来酸、抗坏血酸等组分。常用的高效液相色谱柱为C18色谱柱。对高效液相色谱条件的优化主要包括检测波长的选择、流动相的选择、柱温和流速的选择等。

4.1 检测波长的选择

对茶叶中常见的有机酸组分在紫外波长下进行光谱扫描，结果表明大部分有机酸在210 nm处有较大吸收[23]，但抗坏血酸在245 nm处有最大吸收，因此对茶叶中的有机酸进行测定时，检测波长一般选择210 nm，对抗坏血酸选择在245 nm波长下进行检测。

4.2 流动相的选择

对有机酸的测定一般选择在紫外区几乎无吸收的磷酸盐溶液作为流动相，目前常用的流动相为磷酸二氢钾[23]。有机酸为弱酸，在水溶液中存在解离平衡，解离程度受溶液pH控制，为了使有机酸能够以分子形式在反相柱上保留，可通过调节流动相的pH，提高H+浓度来达到抑制解离、改善分离效果的作用[28]。一般采用磷酸来调节流动相的pH，现有研究表明，当pH>3.0时，一些有机酸组分不能完全分开，但pH太低时大部分有机酸的保留时间缩短，同样会影响分离效果，而且低pH的流动相会影响色谱柱的柱效及使用寿命[1]，因此需根据所测有机酸的种类来确定流动相的最适pH，一般选择pH为2.6～2.8。磷酸盐浓度的高低直接影响其缓冲容量的大小，影响有机酸存在形式的稳定性，从而影响分离效果，磷酸盐浓度越高，有机酸的存在形式越稳定，但浓度过高时离子强度增大，对有机酸的分离不利，同时，磷酸盐浓度太高会对泵和色谱柱的寿命产生影响，因此磷酸二氢钾的浓度一般选择0.01～0.05 mol/L。有研究表明在流动相中添加适量的甲醇可有效改善峰形，有利于有机酸组分的分离，但随着甲醇含量的增加，有机酸的疏水基与固定相的相互作用减弱，保留时间下降，可能会造成部分有机酸组分的分离度降低[38]。

4.3 柱温和流速的选择

随着柱温的升高，检测时间缩短[6]，部分有机酸的分离度可能会降低；随着流速的提高，各有机酸组分的保留时间缩短，但流速过高会使柱压升高，影响有机酸组分的分离度，而且不利于色谱柱的保护与长期使用，而流速过低时会导致色谱峰的峰形较宽，部分有机酸可能会出现拖尾现象，因此需根据所测有机酸的种类进行综合考虑。

5 展望

高效液相色谱法是目前常用的有机酸测定方法，《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》（GB 5009.157—2016）规定了采用高效液相色谱法检测食品中酒石酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸和己二酸的测定方法，但该标准只适用于对果汁及果汁饮料、碳酸饮料、固体饮料、胶基糖果、饼干、糕点、果冻、水果罐头、生湿面制品和烘焙食品馅料中的有机酸进行测定[40]。目前高效液相色谱法也逐步应用于对茶叶中的有机酸进行分析，但茶叶的基质复杂，其中的很多组分可能会干扰目标物的测定，因此选择合适的样品前处理方法是采用高效液相色谱法测定茶叶样品中有机酸的关键。此外，有机酸在紫外波段基本无特征吸收，因此常选择在210 nm附近检测，但在该波段灵敏度相对较差，因此需要针对不同的茶类不断优化高效液相色谱条件，建立适用的有机酸检测方法，并制定相应的检测标准。

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