一款含肌醇乳液的保湿紧致功效评价

张帆 李梅 黎远生 黎青勇 万阳 陈钰莹

目的：采用体外试验和临床试验相结合的方法，评价含肌醇乳液的功效性和安全性。

方法：体外保湿功效通过透明质酸酶活性抑制实验进行评价，体外紧致功效通过弹性蛋白酶活性抑制实验进行评价；临床试验选取35例具有皮肤老化特征的受试者以自身前后对照进行评价。

结果：体外试验结果显示，该含肌醇的乳液对透明质酸酶活性的抑制率为41.00%，对弹性蛋白酶活性的抑制率为12.30%；临床试验结果显示，连续使用该产品4周后，表皮层水分含量改善率为4.28%（P＜0.01），角质层水分含量改善率为27.10%（P＜0.001），弹性R2值改善率为6.14%（P＜0.01），平坦度Sa值改善率为3.51%（P＜0.05），且整个测试过程中均未发生不良反应。

结论：该含肌醇乳液具有良好的保湿和紧致功效。

关键词：肌醇；保湿；紧致；体外测试；临床实验

肌醇（Inositol）广泛存在于自然界中，在新鲜水果、蔬菜及谷物中含量较高，能够参与动植物细胞中相关的物质代谢活动。据研究报道，肌醇作为胰岛素信号通路的第二信使作用于代谢途径，给药后发挥胰岛素增敏和模拟作用，并能降低血糖，促进肝糖原合成[1]，已被广泛用于与胰岛素抵抗相关的病理治疗，如多囊卵巢综合征（PCOS）和糖尿病[2，3]。有学者综述肌醇在生物医学领域的应用，阐述肌醇在治疗衰老和相关神经退行性疾病中的作用及分子机制[4]，表明肌醇在人类相关疾病的治疗中发挥重要作用。近年来，肌醇在食品、医药乃至化妆品等多领域的应用受到广泛关注。

肌醇又名环己六醇，是B族维生素中的一种水溶性维生素。如果皮肤缺水，导致水油不平衡，皮肤表面的pH值发生变化，将会导致皮肤容易敏感[5]。肌醇可通过调节油脂分泌实现水油平衡，持续补水，控制皮脂，并提供抗氧化等抗衰老因子[6]，从而达到保湿效果。另一方面，肌醇能使血小板衍生因子（PDGF-BB）的产生量显著增加，而PDGF-BB又是真皮干细胞所需的关键物质，能增强真皮干细胞的分泌能力，有助于提高真皮的再生和修复水平，从而达到抗皱/紧致效果。因此可将肌醇用于抗衰老化妆品中。

透明质酸酶广泛存在于动物组织和微生物中，可降解透明质酸，在皮肤中透明质酸主要通过水合作用保持皮肤水分[7]；弹性蛋白分布于真皮组织，使皮肤具有弹性，弹性蛋白酶主要负责降解弹性蛋白[8]，本文通过透明质酸酶抑制实验和弹性蛋白酶活性抑制实验以研究该含肌醇乳液在体外保湿和紧致维度上的效果。

表皮层水分含量和角质层水分含量可客观表征皮肤水分含量[9]，平坦度Sa值可客观表征皮肤粗糙程度[10]，弹性R2值应用较广且具有较高的市场认可度可用于表征皮肤弹性[11]。本文通过28天临床使用试验，测试该4个客观指标以研究该乳液对人体的保湿、紧致效果，并通过受试者自评和不适应症观察研究该乳液的试用者喜好度以及临床安全性情况。

Part 1

实验部分

1．1 主要试剂与仪器

1.1.1 乳液制备：试剂：丙烯酸（酯）

类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物，Lubrizol Advanced Materials， Inc.；阿拉伯胶树（ACACIA SENEGAL）胶、黄原胶，SEPPIC S.A.；肌醇，TSUNO RICE FINE CHEMICALS CO.，LTD.；1，3-丙二醇，Primient Covation LLC；甘油，PTMUSIM MAS；氢化卵磷脂，NIPPON SURFACTANTINDUSTRIES CO.， LTD.；甘油三（乙基己酸）酯，STEARINERIE DUBOIS Fils S.A.；辛基聚甲基硅氧烷，迈图（上海）贸易有限公司；生育酚乙酸酯，帝斯曼营养产品有限公司；山嵛醇，巴斯夫（中国）有限公司；对羟基苯乙酮，烟台东方化学有限公司；1，2-己二醇，德之馨香精香料（南通）有限公司。仪器：MDB45305型生物显微镜，日本Nikon公司。

1.1.2 体外试验：试剂：透明质酸酶，默克Sigma-Aldrich公司；透明质酸钠，默克Sigma-Aldrich公司；对二甲基苯甲醛，上海麦克林生化科技股份有限公司；甘草酸二钾，阿拉丁试剂（上海有限公司），弹性蛋白酶默克Sigma-Aldrich公司；N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-p-硝基苯胺（AAAPAN），默克Sigma-Aldrich公司；西维来司钠，默克Sigma-Aldrich公司。仪器：Infinite E PLEX型多功能酶标仪，TeCAN公司；QL-901型涡旋仪，德国IKA公司；HHS11-1型恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司。

1.1.3 临床试验仪器：MoistureMeter Epid型表皮层水合测量仪，芬兰Delfin公司；MoistureMeter SC型角质层水合测量仪，芬兰Delfin公司；Primos Lite型皮肤快速三维成像系统，美国LMI公司；Cutometer型皮肤弹性测量仪，德国CK公司；VISIA-CR 2.3型皮肤图像测量仪，美国Canfield公司；C-Cube型成像仪，法国Pixience公司。

1.2 含肌醇的乳液的制备

见表1配方，将A相投入生产锅搅拌溶胀均匀；B相在外置容器80℃下分散均匀，投入预先90℃溶解混合均匀的C相的料体，搅拌均匀，保温搅拌，快速降至常温，将B+C相投入生产锅，搅拌均匀；投入D相和预先60℃混合溶解并降至常温备用的E相至生产锅，搅拌均匀，出料。

通过配方形成的液晶结构（见图1）可以包裹活性物，进而促进活性物在皮肤上的渗透。液晶结构与人体细胞膜的磷脂双分子层结构类似，根据相似相溶原理，液晶相与细胞间脂类相互作用，角质层形成更易渗透的脂质通道，促进活性成分的渗透，有利于功效成分发挥作用[12，13]。肤感方面，由于乳液的液晶层是由乳化剂双分子层与结合水周期性层状排列而成，层与层之间由于含大量结合水而容易相对滑移，使乳液更易铺展于皮肤表面，具有优于普通乳液的清爽、柔滑的肤感[6]，有利于提高后续临床受试者的配合度。制备乳液进行测试，还可以减少部分单一原料功效效果与实际应用于产品时存在功效效果差异的问题[14]。

1.3 功效评价

1.3.1 透明质酸酶抑制实验：以甘草酸二钾为阳性对照[15]，将其依次配制成50、80、100、160、200μg/mL溶液，取50μL 30mg/mL透明质酸酶液与50μL含肌醇的乳液或阳性对照混合，于37℃孵育20min；加入100μL 12.5mmol/L CaCl2溶液，于37℃孵育20 min；加入250μL 3mg/mL透明质酸钠溶液，于37℃孵育40min；加入100μL 0.4mol/L NaOH溶液和100μL 0.4mol/L四硼酸钾溶液，置于沸水浴中加热3min后，立即置于冷水中冷却5min；加入3mL 10mg/mL对二甲氨基苯甲醛溶液，放置20min显色；吸取250μL上清液加入96孔板中，于540nm下进行测定吸光度，每个样品3个平行，至少重复2次。

根据所测吸光度值，计算透明质酸酶抑制率（R），公式为：R=（1-OD545样品组/OD545阴性对照组）×100%，绘制阳性标准曲线，阳性对照IC50在100μg/mL-200μg/mL范围内认为系统有效。

1.3.2 弹性蛋白酶活性抑制实验：以西维来司钠为阳性对照[16]，将其依次配制成2、5、10、20、30μM溶液备用。取90μL Tris-HCl缓冲液与30μL 5.0mmol/L AAAPAN溶液混合后，加入50μL含肌醇的乳液或阳性对照，在25 ℃下孵育15min，随后加入30μL 0.2U/mL弹性蛋白酶溶液，在25℃下孵育15min后在410 nm下进行测定。每个样品做3个平行，重复至少2次。

根据所测吸光度值，计算透明质酸酶抑制率（R），公式为：R=（1-OD410样品组/OD410阴性对照组）×100%，绘制阳性标准曲线，阳性对照IC50在5μM-20μM范围内认为系统有效。

1.3.3 临床试验：（1）受试对象 ：本试验共观察皮肤出现老化的受试者35例，其中男2例、女33例，平均年龄50.03岁。依据《赫尔辛基宣言》，受试者知悉本次测试详情，且自愿参加本次测试并签阅知情同意书。在知情同意书中，明确解释了与参与研究相关的可能风险、益处、权利和义务的所有必要信息。

（2）入选标准：①年龄为18-65 岁，健康，性别不限；②皮肤弹性R2值≤0.65；③自愿参加试验，愿意签署知情同意书。

（3）排除标准：①正在接受皮肤科治疗的，患有皮肤病的人群；②正在接受治疗的哮喘或其他慢性呼吸系统疾病患者；③近2个月面部使用任何抗炎药物；④胰岛素依赖糖尿病患者；⑤近5个月内接受抗癌化疗患者；⑥哺乳期或妊娠期妇女；⑦过敏体质者、过敏性皮肤炎等人群，有皮肤病或疾病史；⑧严重系统疾病、免疫缺陷或自身免疫性疾病者；⑨近1个月曾使用过激素类药物及免疫抑制剂者；⑩面部有皮损或大面积胎记、抓痕、白斑、色素痣、疤痕疙瘩等影响试验的皮肤表征；?近6个月内接受过影响皱纹状态的美容手术或其他美容方式者；?近6个月内使用过肌肉松弛制剂者；?近1个月内参加过其他临床试验者。

（4）研究方法：本研究采用自身前后对照研究，35例受试者每天早晚将1mL含肌醇的乳液均匀涂抹于脸部，共使用28天。分别于第0天、第28天进行安全性及有效性评估。测试时，统一在无阳光直射，无风，室温20℃～22℃，湿度40%～60%的室内环境进行。受试者清洁皮肤后，静坐20 min后，取躺位进行测试，每次测量均分别选取左右面部同一部位，同一部位共测量3次，取平均值。

（5）安全性评价：临床观察期间，实验室对受试者进行不良反应评价，包括：研究部位是否出现瘙痒、干燥、脱屑或刺痛等症状。

（6）无创性皮肤生理功能测试：表皮水分含量测试：采用MoistureMeter Epid测量仪测定皮肤表皮层水分含量，结果表示为表皮层水分含量改善率=[（使用样品后-使用样品前）/使用样品前]x100%；角质层水分含量测试：采用MoistureMeter SC测量仪测定皮肤角质层水分含量，结果表示为角质层水分含量改善率=[（使用样品后-使用样品前）/使用样品前]x100%；皮肤平坦度测试：采用Primos Lite皮肤快速三维成像系统测量皮肤平坦度Sa值，结果表示为平坦度Sa值改善率=[（使用样品前-使用样品后）/使用样品前]x100%；皮肤弹性测试：采用Cutometer皮肤弹性测量仪测定皮肤弹性R2值，结果表示为弹性R2值改善率=[（使用样品后-使用样品前）/使用样品前]x100%；图片采集：采用VISIA-CR 2.3皮肤图像测量仪和C-Cube成像仪拍摄受试者使用产品前后对比图片。

（7）受试者自评：受试者使用受试品28天后对产品整体满意度、保湿效果满意度和紧致效果满意度按5分标准评估：5分=极明显改善；4分=明显改善；3分=改善；2分=轻度改善；1分=无改善。受访时，受试者通过填写问卷对产品的整体抗皮肤老化效果进行评价。

1.3.4 数据统计分析：采用Graphpad prism 8.0统计软件对数据进行统计学分析，结果表示为：平均值±标准差。采用单因素方差分析方法计算不同组之间的显著性差异。对于临床结果分析，进行正态分布检验，符合正态分布要求，自身前后的比较采用配对t检验，否则采用两个相关样本秩和检验，显著性水平均为P＜0.05。显著性“ns”表示P＞0.05，“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。

Part 2

结果

2.1 体外试验结果

2.1.1 含肌醇的乳液抑制透明质酸酶活性实验：酶标仪检测透明质酸酶标准溶液与底物HA的反应并做回归曲线分析，得到回归方程为y= -0.000 066 09x2 + 0.307 8x - 0.096 86，R2=0.994 3，甘草酸二钾的IC50值为156.09±2.84μg/mL，其对透明质酸酶活性抑制率曲线，见图2A；

该含肌醇的乳液对透明质酸酶活性的抑制率达41.00%（见图2B），相当于浓度为100μg/mL-160μg/mL的甘草酸二钾的抑制效果，这表明含肌醇的护肤品可有效抑制透明质酸酶活性，预示在化妆品功效应用中能表现出良好的保湿功效。

2.1.2 含肌醇的乳液抑制弹性蛋白酶活性实验：

酶标仪检测弹性蛋白酶标准溶液与底物AAAPAN的反应并做回归曲线分析，得到回归方程为y= -0.108 9x2 + 5.59x +4.868，R2 =0.977 9，西维来司钠的IC50值为10.05±0.57μM，其对弹性蛋白酶活性抑制率曲线，见图3A；

该含肌醇的乳液对弹性蛋白酶活性的抑制率可达12.30%（见图3B），这表明含肌醇的护肤品可有效抑制弹性蛋白酶活性，预示在化妆品功效应用中能表现出抗皱或紧致功效。

2.2 临床试验结果

2.2.1 一般资料：31例受试者完成为期28天的临床测试，4 例因未能在规定的时间内到访而脱组。其中有效例男2例、女29例，平均年龄50.55岁。

2.2.2 无创性皮肤生理功能测试：皮肤衰老是一个复杂的过程，主要的临床表现有皮肤结构，功能和外观的累积性变化，如皱纹增多，松弛，弹性减退，毛细血管扩张，皮肤色素异常等[17]。此外，皮肤角质层的水分容易因汽化而水分含量急剧减少，容易导致皮肤干燥等不良现象，通过无创性仪器测试可客观表征皮肤生理情况。通过本次临床测试（数据结果见表2和图4），使用产品28天后皮肤表皮层水分含量、角质层水分含量和弹性R2值在使用后第28天较第0天高，差异有统计学意义（P＜0.05）；平坦度Sa值在使用后第28天较第0天低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明该含肌醇的乳液使用后可以增加皮肤的水分和弹性，使皮肤平坦更细腻，具有良好的保湿和紧致效果。产品使用后，脸部具有综合改善效果，见图5和图6。

2.2.3 受试者自评：受试者自评见表3，在产品整体满意度评价结果中，评分≥ 4 分的受试者占比100%，平均分为4.55；在保湿整体满意度评价结果中，评分≥ 4 分的受试者占比96.77%，平均分为4.58；在紧致整体满意度评价结果中，评分≥ 4 分的受试者占比87.10%，平均分为4.23。说明该31 位受试者对该含肌醇的乳液保湿、紧致效果较为满意。

2.2.4 安全性评价 ：31 例受试者均未发生明显不良反应，说明该含肌醇的乳液具有良好的临床安全性。

Part 3

结论与展望

本文通过实验设计，采用体外和临床试验相结合的方法，进一步验证了含肌醇乳液的保湿和紧致功效。其中，体外透明质酸酶抑制实验和弹性蛋白酶活性抑制实验结果表明该含肌醇乳液可有效抑制透明质酸酶和弹性蛋白酶活性；临床试验结果显示31 位受试者自评对产品保湿、紧致效果较为满意，且可以显著增加皮肤水分含量和弹性，说明该含肌醇乳液具有良好的保湿和紧致功效，可在一定程度上延缓皮肤衰老，适用于预防皮肤老化。

早在1988 年，研究发现肌醇是角质形成细胞生长所需的营养素[18]，为肌醇在化妆品中的应用打开新篇章。在当前化妆品应用中，肌醇可以发挥保湿、滋润、抗皱、紧致和舒缓皮肤的作用，然而相关应用案例报道不多。肌醇在化妆品领域具有较好的开发价值和开发前景，本文对其保湿和紧致功效做了进一步验证研究，为肌醇的应用提供了理论和实验参考，后续可对其作用机理和其它功效进行深入探讨和研究。

作者介绍

张 帆，李 梅，陈钰莹：供职于广州益养生物科技有限公司。

黎远生，黎青勇，万 阳：供职于广州暨大美塑生物科技有限公司。

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