网络毒理学在中药研究中的应用现状与思考

谢晓 刘敏 杨敏 刘钱 田佩灵 曾珊 刘涛

收稿日期：2023-04-14

基金项目：四川省2021—2023年高等教育人才培养质量和教学改革项目（JG20211106）；成都大学2021—2023年研究生人才培养质量和教学改革项目（cdjgy2022004 ）

作者简介：谢晓（2002—），女，从事中药新药开发及质量再评价研究.Email：2941207759@qq.com

通信作者：刘涛（1976—），男，博士，研究员级高级工程师，从事中药再评价研究.Email：liutao0578@sina.com刘敏（1981—），女，从事药物再评价研究.Email：752544391@qq.com

摘要：网络毒理学是对中药多个“成分—靶点—通路”进行分析，从而预测毒性成分和探究毒性机制的方法.近年来，网络毒理学应用广泛，对其研究方法和应用现状进行综述，并对其面临的问题进行讨论，以期为网络毒理学在中药中的进一步应用提供参考.

关键词：网络毒理学；中药；应用；毒性机制；毒性成分

中图分类号：R285

文献标志码：A

0引言

网络毒理学可用于中药毒性成分的预测和毒性机制的探究.网络毒理学的提出标志着中医药方面的研究在网络药理学的基础上已向生物学和计算机科学等多个学科层面迈进，促进了中医药的发展.本文以中国知网、维普资讯和ScienceDirect online数据库的文献为基础，主要对网络毒理学在中药领域的研究方法和应用现状进行综述，拟为认识学习和深入研究网络毒理学提供参考依据.

1网络毒理学简介

1.1基本定义

网络毒理学是一种源于网络药理学，可以对药物进行多个“毒性成分—靶点—通路”分析，从而初步揭示药物毒性机制的研究技术，是一种结合生物学和计算机科学等学科建立毒性预测评价模型，初步阐释毒理性质的重要方法［1］.网络生物学和网络药理学概念的提出及其相关领域的研究为网络毒理学的发展提供了全新的思路.为提高中药的安全性，将网络药理学的“疾病（药物治疗对象）—基因—疾病靶点—药物”相互作用网络衍生为“毒性（副作用）—基因—毒性靶点—药物”相互作用网络，药理学数据库转变为毒理学数据库，关键词从某种“疾病”变成了某种“毒性（副作用）”，从而产生了网络毒理学这一毒理学分析模型［2］.网络毒理学具有研究成本低、临床试验成功率高和毒副作用低等特点，可用其解释中医药的内涵，为中医药的现代化发展做出一定贡献［3］.网络毒理学技术主要运用了分子相互作用技术、网络可视化技术和高通量/高内涵技术等［4-5］，其发展与网络药理学、基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学和免疫组学等息息相关.

1.2常用研究工具

应用网络毒理学时离不开各种数据库、软件和平台.网络毒理学常用的研究工具见表1，研究人员应根据其研究内容的深度和广度选择较为合适的数据库.另外，进行毒性预测的TOPKAT、Hazard Expert和DEREK等软件，以及化合物致癌毒性预测系统（PSCT）等也是研究人员常用的毒性预测工具［4-6］.

1.3研究思路与方法

网络毒理学是基于成分、基因、蛋白和通路构建的用于寻找单味中药或方剂中的有毒成分，并阐述有毒单味中药或方剂的毒性机制，以及诠释中药配伍禁忌的内涵等的方法［2］.网络毒理学的研究流程主要通过收集化学成分、候选毒性化合物、候选化合物靶点与疾病靶点，构建“成分—靶点—通路”网络，并进行GO和KEGG分析.值得一提的是，目前尚未有研究表明网络毒理学具有特有的毒理学靶点.一方面，疾病和毒性（副作用）的靶点会有重合现象，不同毒性成分对应的基因有重叠，而不同基因对应的靶点也可能相同，这与不同数据库的分析方法有差异相关；另一方面，因为中药的成分组成较为复杂，且有效成分的临床使用与量效有密切关系，在两种不同的药材中同一种成分可能一个起到治疗作用，而另一个会产生毒性反应.简而言之，靶点是网络药理学和网络毒理学二者通用的，根据不同数据库、筛选条件和分析目的的选择可得到相应的结果［2-3］.

1.3.1中药成分收集

中药富含多种成分，根据某些毒性反应（副作用）相关的毒性化合物结构的相似性可构建“化合物—化合物”网络，再加入结构明确的中药成分进行网络分析，与已知毒性化合物处于同一组的则为潜在毒性化合物.常用TCMSP数据库查询出中药的所有成分，再以生物利用度OB≥30%及类药性DL≥0.18的标准进行进一步筛选与该中药相关度较高的化合物［10］，建立“药材—成分”数据库.其次，利用毒理基因组学CTD数据库以“毒性名称”作为关键词对TCMSP得出的成分进行毒性查询，筛选得到候选毒性化合物.

1.3.2毒性靶点筛选

在得到毒性靶点的过程中，可根据实际情况选择不同的筛选方法.当通过网络毒理学探究中药的毒性及其机制时，可采用PubChem数据库查询候选毒性成分的代谢物结构，将其作为关键词在Swiss TargetPrediction数据库中进行搜索，选定物种，得到靶点蛋白和Uniprot ID，以靶点蛋白名称为关键词在Uniprot数据库中搜索得到靶点基因［15］.另外，Uniprot数据库的数据完整性还有待提高，在搜索不到靶点基因时，可结合PharmMapper数据库进行补充完善.在探究中药某一特定的毒性类型或疾病类型时，可直接以疾病名称为关键词在GeneCards或CTD数据库中进行搜索，根据相关性得分选取大于中位数的毒性靶点［11］.

1.3.3构建蛋白互作网络

当通过网络毒理学探究中药的毒性及其机制时，可利用STRING数据库建立“成分—靶点蛋白”互作网络，限定物种为人，得到蛋白互作网络；而在探究中药某一特定的毒性类型或疾病类型时，可先用Venny网站获取候选毒性成分与疾病的交集靶点，再导入STRING中得到“靶点—靶点”互作网络.

1.3.4GO和KEGG分析

利用STRING数据库对交集基因进行GO 分类富集分析.分别选择分子功能、生物学过程和细胞组分分析靠前的结果.使用DAVID工具进行KEGG通路富集分析，使用Omicshare 数据库将筛选出的KEGG通路信息绘制成气泡图，并将所得到的通路均用GraphPad Prism 6.0 绘制柱状图［11］.

1.3.5数据可视化

将上述获得的成分、靶点和通路信息导入Cytoscape3.6.0进行可视化分析，并获取网络拓扑参数，根据Degree值，选取大于中位数或大于中位数2倍的数值作为关键毒性成分、靶点和通路.

1.3.6数据分析

根据构建的“成分—靶点—通路”对中药的毒性机制或中药配伍内涵等进行阐释.

2应用现状

中药一直被认为毒副作用少，疗效好，但近年来相关报道发现，中药无论是单用、配伍或是复方使用都可能对心脏、肝脏和肾脏等产生一定的毒性［1］，网络毒理学的出现对中药产生的毒性机制可进行初步阐释.

2.1在单味中药中的应用

中药的作用机制具有多靶点的特点，对其进行毒理机制研究较困难，而网络毒理学的出现解决了这一难题.目前，网络毒理学在对单味中药的毒性成分筛选，以及单味中药对肝脏、心脏和肾脏等毒性机制探究方面有着广泛的应用.

仅用网络毒理学对单味中药进行探究，研究方法较为单一，数据可信度较低，但可初步解释毒性机制.例如，李洁等［16-17］筛选出鱼腥草6种毒性成分，表明鱼腥草可能是通过多信号通路引发过敏反应、抑制中枢神经系统和影响细胞凋亡等产生毒性，大黄主要通过影响钙离子通道和细胞凋亡产生毒性.另外，梁雨璐等［11］通过网络药理学对合欢皮抗焦虑机制与网络毒理学对合欢皮产生肾毒性机制的研究表明，合欢皮的治疗机制与毒性机制相差较大，提出减少毒性成分皂苷类化合物的同时，最大限度地保留木脂素类化合物的临床应用思路，以此减少合欢皮的肾毒性，又可以保证其抗焦虑药效.基于网络药理学和网络毒理学的整合研究，卫博文等［18］发现，雷公藤其毒/效机制高度一致，发挥药效和毒性的成分和靶点都较一致，表明雷公藤既可治疗免疫性肝脏损伤也可以产生一定的肝脏毒性，该研究充分阐释了中药中“有故无殒”的内涵.

随着科学技术的发展，网络毒理学结合多种技术如分子对接、动物实验、代谢组学、基因转录组学、免疫组学和细胞实验等技术进行验证，可以更加准确地阐释中药毒性机制，又可以评估网络毒理学的预测水平.

网络毒理学与分子对接技术结合可很好地验证中药毒性成分与毒性靶点的结合活性和相互作用能力，提高数据的可信等级.例如，郭小红等［19］基于网络毒理学中的admetSAR 2.0平台预测闹羊花中二萜类化合物的毒性，且毒性等级为“Ⅲ”级的有11个，证明毒性成分的官能团是闹羊花毒性大小的决定性因素，并结合长期毒性试验和代谢组学研究表明，闹羊花对肝脏、心脏和神经有较大的毒性，也与相关报道相符，进一步验证网络毒理学的准确高效性.此外，杨雪等［20］基于虚拟策略的网络毒理学方法，初步筛选出商陆皂苷甲为商陆中潜在的肾脏毒性成分，并用蛋白质印迹法和整体动物酶联免疫吸附剂测定法初步预测其诱导大鼠肾脏毒性的产生与NFκB信号、磷酸化IκBα靶蛋白、下游炎症因子TNFα和IL1β密切相关.孔娇等［21］针对八角莲醇提液所致的肝脏毒性提出“量—权—证”的研究思路，首次将含量纳入网络毒理学靶点筛选，预测出的八角莲肝脏毒性成分更准确，并且发现八角莲对肝脏细胞没有损伤，主要通过调控氧化应激、细胞凋亡和炎症反应对肝组织有一定程度的损伤.

对利用网络毒理学探究单味中药毒性机制较为明确的20余篇文献进行分析，研究结果见表2，可以发现，中药产生的毒性主要是肝脏毒性，而表中的几种毒性机制主要集中在调控氧化应激、炎症反应、细胞周期和细胞凋亡（又称程序性死亡）的过程中.肝脏是机体代谢的主要场所，在药物的临床使用中出现肝脏毒性的比率较其他毒性较大.因此，肝脏毒性需引起重视，如何更好地完善肝毒性的评价体系是中药研究中面临的难题.故可对上述出现频率较高的机制进行“对症下药”，减少药物的毒性.此外，只有少数研究采用体内外实验对网络毒理学分析结果进行验证，因此，可考虑建立应用网络毒理学时结合体内外实验验证的最低标准，以保证研究结果的质量.

2.2在中药配伍中的应用

目前，网络毒理学在中药配伍中的应用主要是阐述机制，为揭示中药配伍禁忌起到参考作用.淫羊藿和补骨脂2味药单用已被证实有一定的肝脏毒性，有研究发现，二者的联用会加重肝脏毒性，如壮骨关节丸和仙灵骨葆胶囊.淫羊藿和补骨脂除了自身的多个成分具有肝脏毒性外，还通过NLRP3炎症小体为联系纽带，以自身活性成分协同毒性成分诱发NLRP3炎症小体持续活化.此外，时潇丽等［37］发现，补骨脂和淫羊藿配伍毒性加剧的机制是通过关键毒性成分与核心靶点相互作用与肝脏细胞中部分蛋白氧化磷酸化及相互结合等.

网络毒理学的应用可解释中药配伍减少药物毒性的原因.研究发现，结合网络毒理学和药物动力学得到淫羊藿的毒性成分以黄酮类化合物为主，而淫羊藿和女贞子配伍能够显著减少淫羊藿中5种黄酮类成分在体内的富集，可减少其毒性［30］.柴胡中的毒性成分为柴胡皂苷和挥发油，柴胡与甘草、白芍、当归和黄芩的关联程度较高，通过网络毒理学得出共有的肝脏毒性靶点，发现甘草、白芍、当归和黄芩4味中药均参与阿尔茨海默病与化学致癌DNA加合物等通路，与PTGS2相互作用密切，这4味中药常与柴胡配伍“相杀”减轻柴胡的肝脏毒性［38］，上述靶点通路可能是配伍时拮抗肝脏毒性的潜在靶点和通路.通过配伍，2种药物的共同靶点作用于同一个信号通路但二者的作用相互拮抗，则可以减轻甚至阻断毒性成分和毒性靶点在共同信号通路的作用，这是减少中药肝脏毒性的一种思路.

2.3其他应用

网络毒理学在中药中的常见研究思路通常为有毒成分的预测，中药毒性机制的阐述，中药配伍禁忌理论内涵的解释，中医与西医的相互解释.由于中药成分的复杂和网络毒理学的局限性，对于复方中药的相关毒性研究结果具有争议，因此相关研究较少.随着网络毒理学在中药研究中的广泛应用，可用来区分寒性药物和热性药物.寒性药物和热性药物的关键靶蛋白在生物通路、作用疾病及毒理作用上存在差异，林林［39］和梁非［40］通过网络毒理学发现，促进或抑制细胞的生长率和增殖率相关基因，以及能量代谢相关基因的表达是区分2种药物的关键所在.此外，可通过挖掘单味药物的药理作用，并基于单味药物的药理作用开展方剂药理作用研究，以特定疾病为例，用网络毒理学评估其毒性大小，验证方剂治疗疾病的合理性.

3结语

网络毒理学研究成本低，涉及学科广，促进了中药的发展，在探究中药毒性机制方面具有重要意义.但网络毒理学预测毒性成分具有一定的局限性：1）中药结构不稳定，在配伍或是复方中可能会产生新的物质，而网络毒理学在探究毒性机制的过程中是将单味中药的毒性成分和毒性靶点进行筛选后简单叠加，表明网络毒理学预测非单味中药的毒性成分和机制不一定准确.2）目前，有文献报道，确切毒性成分未出现在网络毒理学预测的范围内里，而预测出的某些毒性成分还尚未有文献研究，因此，需结合后期实验验证才能更准确地预测中药的毒性机制.3）目前，网络毒理学面临数据库不完善、筛选成分标准不统一（且没有考虑剂型）和数据分析结果不准确等问题，且绝大多数数据库是国外研发的，国内研发的还比较少.4）利用网络药理学筛选出的活性成分并不是中药材现行标准中的主要质控成分或药材中含量较高的成分，如何评价和处理这一差异是一难题.同时，网络药理学筛选出的部分活性成分存在相似度高的问题［41］.5）网络药理学筛选得到的有效成分只能定性，不能体现其在中药材中的含量，筛选得到的有效成分是否可以在临床使用中达到“量—效”关系而发挥作用还有待进一步研究.其次，不同部位的药材成分含量可能不同，比如药用部位和非药用部位［41］，在数据库中不能得以体现.

网络毒理学单用数据可靠等级较低，同时其以已有数据库为基础进行研究，其结果受所用数据库数据准确性的影响 .因此，对于研究结果，应灵活结合多项技术进行体内与体外试验进行验证，从而提高可靠性.将网络毒理学、质量标志物和代谢组学结合，可更准确地推断出毒性成分，为中药的毒性机制和安全性评价提供基础，此外，可参考于瑞等［42］整理的毒性预测评价模型.利用网络毒理学研发出更多的新药，并且提高中药的安全性是科研人员面临的难题.目前，“网络靶标”理论已成为网络药理学的核心理论，网络药理学解析药物及治疗对象之间的分子关联规律，其研究理念与中医药学的整体论思想不谋而合，被广泛应用于药物和中药活性化合物的发现、整体作用机制阐释、药物组合和方剂配伍规律解析等方面，为临床安全用药、新药的研发和中药复杂体系的研究提供了思路和支撑.相信后续通过网络药理学的相关研究思路，对网络毒理学的研究也更加深入，并逐步解决上述面临的难题，力争将网络毒理学存在的价值发挥到极致，提高中药的安全性.

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（责任编辑：伍利华）