基于星型胶质细胞探讨针刺治疗缺血性脑卒中机制的研究进展

谭信哲,王东岩,董 旭,王若愚,韩沂晓,廖智超,王庚鉴,李东霞

1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001

缺血性脑卒中(Cerebral ischemic stroke,CIS)又称脑梗死,是由各种原因所致脑组织缺血缺氧性坏死,并伴随神经功能缺损的疾病。目前CIS的治疗方法包括急性期的神经保护、亚急性期的亚低温治疗和恢复期的干细胞治疗[1]。星型胶质细胞(Astrocytes,AS)是中枢神经系统中数量最多的神经辅助细胞,与神经血管联系密切,在CIS的各个阶段发挥着重要作用。

正常生理情况下,AS处于静息状态,代谢及内分泌保持较低水平,而在脑缺血等病理状态下,AS会被各种途径激活,形成反应性星形胶质细胞(Reactive astrocytes,RAS)。RAS分泌及信号传导能力大幅度增强,在保护神经元的同时也对神经系统造成损伤。2012年Zamanian J L等[2]通过细胞纯化和基因表达分析,发现全身性脂多糖注射和大脑中动脉栓塞(MCAO)诱导两种不同类型的RAS,现在分别称为A1和A2型RAS。A1型RAS主要介导炎症反应和产生神经毒性,加速神经系统损伤,A2型RAS能够通过产生多种抗炎及神经保护因子,保护神经元免受缺血损害[3]。AS的活化表型并不是一成不变的,其表型受到细胞外刺激因素的影响以及相关治疗方法的调控。A1、A2表型是对RAS功能的分类,促进AS向A2表型转化是治疗CIS的一个非常有潜力的研究方向。针刺治疗具有多靶点、多途径和多环节调节的特点,在卒中治疗中应用广泛。针刺能够通过调控AS及其相关分子促进CIS损伤恢复,现将相关机制概述如下。

1 针刺对AS的整体调节

1.1 针刺对AS活化的影响

CIS发生后,适当的AS活化有利于神经损伤修复,但是过度活化会加重神经元损伤。目前研究多以胶原纤维酸性蛋白(GFAP)作为AS活化的标志物。GFAP是AS细胞骨架的主要组成成分,对维持AS形态及发挥各种功能具有重要作用。生理状态下GFAP生成很少,在胞内或胞外会自发降解。在脑缺血等中枢性损伤情况下,GFAP会大量增殖。GFAP几乎唯一存在于AS内,是AS活化的标志产物。研究表明,GFAP在CIS发生后呈现先增高后降低的趋势,最高点在卒中发生1周后,而针刺能够减轻GFAP的升高程度[4],表明针刺通过抑制GFAP合成抑制AS活化。STAT3是信号转导子和转录激活子家族成员之一,可与GFAP启动子位点结合,诱导酪氨酸快速磷酸化,促进AS活化增生。研究表明,针刺通过抑制GFAP/STAT信号通路抑制AS活化,减轻脑缺血损伤[5]。

1.2 针刺对AS增生的影响

通过计算梗死周围区GFAP阳性细胞数,Han X等[6]得出结论,针刺具有促进AS增殖,但又抑制AS过度增殖的趋势。由此推断,针刺的治疗作用可能是在CIS早期促进AS增殖,填补修复损伤神经元;在CIS后期抑制AS增生,减少胶质瘢痕的过度生成。

1.3 针刺对AS超微结构的影响

在缺血缺氧条件下,AS因自身基本生理活动无法维持,细胞会逐步走向死亡,超微结构表现为细胞肿胀、细胞器破坏与周围组织连接破坏。针刺能够保护AS超微结构的稳定,维持保护细胞结构的完整性。罗燕等[7]通过透射电镜观察缺血周围区AS超微结构,结果显示,针刺组AS肿胀程度较模型组轻,线粒体较丰富。董卫国等[8]制造大鼠右大脑中动脉闭塞模型,通过电镜观察AS结构,与对照组比较,针刺治疗组AS细胞数目以及完整细胞器较多,与神经元和微血管的接触较多,并且与AS接触神经元的细胞器多。由此可见针刺有助于维护CIS中AS结构的稳定,保证AS对神经元的支持保护作用。

1.4 不同针刺参数对AS的影响

不同的针刺手法、刺激频率以及施术时间对AS的影响不同。通过对比手针和电针对脑梗死大鼠AS的影响差异,叶晓雪[9]研究表明,手针与电针均能够促进梗死大鼠神经功能的恢复,但是电针的治疗效果更理想。通过比较不同电针频率,Xiao Y等[10]得出结论,15 Hz和30 Hz电针频率较100 Hz电针频率治疗CIS的效果更理想,更有利于维持AS结构的稳定性。Young-wook P等[11]把针刺治疗组小鼠分为急性电针组(缺血后立即治疗)、亚急性电针组(缺血后4 d治疗)和延迟电针组(缺血后10 d开始治疗),治疗结果显示,亚急性组的治疗效果最好,更有利于卒中后功能恢复。

2 针刺治疗CIS与AS相关机制

2.1 针刺促进神经再生与修复

CIS发生后,AS通过自身分泌以及促进相关细胞分泌神经营养因子及修复因子保护神经元,促进损伤神经元再生修复。神经生长因子(NGF)是具有神经元营养和促进突起生长双重作用的神经营养因子。脑缺血发生时,RAS释放NGF,提高神经元的存活率。NGF能够促进轴突生长与突起的伸展,诱导神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)转化成神经元。研究表明[12],电针能够抑制大鼠海马区GFAP的表达,促进海马区NGF的表达,改善高脂血症合并大脑中动脉梗阻(MCAO)大鼠神经损伤。脑源性神经营养因子(BDNF)在脑缺血等神经元损害时可由AS、小胶质细胞(MC)等细胞分泌。BDNF能够促进细胞存活、神经发生和突触可塑性。研究表明[13],针刺能够促进AS和MG产生、释放BDNF和NGF,促进神经可塑性,治疗缺血性中风后神经功能障碍。

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)属于转化生长因子-β超家族的成员,在缺血性脑损伤中具有强大的神经保护作用。GDNF在脑缺血发生时的主要来源是RAS,针刺能够促进AS内GDNF的合成,减轻大鼠脑缺血损伤。GDNF能够促进NSCs的生成,研究表明[14]针刺通过促进GDNF和NSCs标志物巢蛋白(Nestin)表达,增加NSCs的增值分化能力,促进大鼠急性脑出血神经重塑。另有研究表明[15],电针对新生大鼠缺氧缺血性脑病的神经保护作用与GDNF及其受体RET介导的下游PI3K/AKT信号通路有关。

2.2 针刺调控兴奋性氨基酸代谢

脑缺血后,脑组织会代偿性产生大量兴奋性氨基酸(主要为谷氨酸)来保持神经元兴奋性。但是过量的兴奋性氨基酸堆积会产生神经毒性,加快神经细胞损伤。AS能够通过摄取过量兴奋性氨基酸,维持细胞间隙正常氨基酸水平。AS主要表达两种谷氨酸转运体(EAATs),分别是EAAT1和EAAT2。其中脑组织中90%的谷氨酸被EAAT2摄取,EAAT2 起着“谷氨酸泵”的作用。针刺能够促进 GFAP、EAAT2含量增长,促进谷氨酸代谢,发挥神经保护作用。Na+/K+-ATP酶通过调控细胞内外离子浓度为EAATs转运谷氨酸提供电化学梯度,针刺能够上调海马Na+/K+-ATP酶和EAATs的表达,减少细胞外谷氨酸堆积,发挥抑制卒中后痉挛的作用[16]。N-myc下游调节基因2(NDRG2)作为一种与癌症相关的基因,在脑缺血后神经细胞凋亡过程中起到促进作用,电针预处理通过抑制EAAT2的下调,逆转NDRG2的上调,诱导脑缺血耐受[17]。

代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)在RAS及活化MC内表达,在脑缺血发生过程中具有神经保护作用。AS上mGluR5的急性激活可以促进EAATs摄取突触间隙的谷氨酸,减小谷氨酸对神经元的兴奋性,减少神经元损伤。研究表明[18],针刺能够减轻兴奋性氨基酸神经毒性,其机制可能与针刺促进mGluR5的表达有关。

大麻素1型受体(CB1R)在神经元和AS内都有表达,AS表达的CB1R主要介导Ca2+信号传递以及调节AS谷氨酸的释放。Yang C等[19]通过电针预处理MCAO模型小鼠,结果显示电针治疗后内源性大麻素水平增加,随后激活AS的CB1R,导致细胞外谷氨酸的适度上调,保护神经元免受脑缺血损伤。Du J等[20]研究结果表明,电针预处理能够促进ERK1/2的表达,且通过CB1R诱导大鼠脑缺血耐受。谷氨酸受体AMPAR中的GluR2亚基决定了的Ca2+通透性,缺血损伤后,GluR2蛋白表达下调,导致大量钙离子进入神经元,使胞内Ca2+超载,造成神经元死亡。电针预处理通过提高大麻素CB1B水平促进下游GluR2分子的蛋白表达,诱导脑缺血耐受,发挥脑保护作用[21]。

大麻素2型受体(CB2R)在中枢神经系统中主要在AS和MC中表达,与活跃炎症密切相关。研究表明[22],电针预处理可增强CB2R表达,抑制Ca2+内流,阻断TLR4/NF-κB信号传导,减轻脂多糖诱导的大鼠炎症。

2.3 针刺调节能量代谢

生理情况下,神经元主要依靠葡萄糖供能,但在脑缺血等病理情况下,神经元也可以通过乳酸代谢供能。在葡萄糖和乳酸同时存在的情况下,神经元可能会优先利用乳酸,乳酸不仅能为神经元供能,还具有直接的神经保护作用。AS-神经元乳酸穿梭假说认为,大量兴奋性氨基酸的摄入,激活AS内糖酵解,产生大量乳酸,AS和神经元通过细胞表面的单羧酸转运体(MCTs)将乳酸转运到神经元,为神经元所利用。AS主要表达MCT1和MCT4,神经元主要表达MCT2。电针治疗能够激活AS乳酸代谢,促进MCT1的表达,促进乳酸的转运及利用,以维持神经元在脑缺血时的能量供应[23]。另有研究表明[24],针刺通过促进MCT2和MCT4的表达,减轻颅脑损伤后因能量代谢障碍引起的继发性脑损伤。

2.4 针刺调控血管再生

促红细胞生成素(EPO)是一种可刺激红细胞生成的糖蛋白。在缺氧情况下EPO可以通过低氧诱导因子诱导其产生。近年研究发现EPO在中枢神经损伤中有重要保护作用。AS是中枢神经系统中产生EPO的主要场所。EPO对脑缺血损伤的保护作用主要集中在促进血管再生和抑制凋亡两个方面。在血管新生方面,Wang L等[25]试验证明,电针水沟可能通过激活EPO/Src/VEGF信号通路促进血管再生。王保国等[26]研究表明,针刺可通过上调EPO的表达,激活JAK2/STAT5信号通路促进下游VEGF表达,促进卒中后血管新生。在抑制细胞凋亡方面,Liu F等[27]研究表明,电针能够促进EPO/JAK2/STAT5信号通路相关基因和蛋白表达,促进凋亡抑制基因Bcl-2表达,抑制凋亡促进基因Bax表达,发挥神经保护作用。

内皮素-1(ET-1)被认为是由血管内皮细胞分泌的具有收缩血管性质的血管活性物质。脑缺血时,活化的AS也能够产生大量ET-1,通过JAK/STAT3途径促进神经祖细胞向AS分化[28]。针刺能够通过抑制脑缺血后ET-1的升高,调节脑血流状态,减少脑缺血损伤。

2.5 针刺减轻氧化反应

脑缺血后的氧化损伤主要表现为两个方面:缺血发生时的自由基损伤和血流再灌注时的活性氧损伤。中枢神经系统能够通过产生抗氧化分子抑制氧化反应的发生,与AS密切相关的是以谷胱甘肽(GSH、GSSG)为核心的谷胱甘肽抗氧化系统。AS能够促进GSH的生成,为神经元提供氧化底物,AS相对于神经元能够释放更多的还原辅酶Ⅱ(NADPH),NADPH能够催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)转化为还原型谷胱甘肽(GSH)。AS还能为神经元提供合成GSH的前体,如谷氨酰胺、半胱氨酸和胱氨酸,表达谷氨酸脱羧酶的AS表现出更高的GSH含量。研究发现[29],脑缺后脑组织中GSH的含量下降,GSSG含量升高,GSH/GSSG比例降低,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性显著降低;针刺能够使已降低的GSH升高、已升高的GSSH降低,提高GSH/GSSH比值,升高GSH-PX活性。表明针刺通过对谷胱甘肽抗氧化系统的整体调整,促进GSH的生成进而减轻脑缺血损伤。蔡娲等[30]研究表明,针刺能够增加GSH生成,降低氧化产物丙二醛水平,减轻氧化应激损伤,发挥神经保护作用。

2.6 针刺抑制AS相关的炎症反应

脑缺血后发生的炎症反应,表现为双重作用,一方面大量炎症因子的产生及炎性细胞的聚集会加重神经细胞损伤;另一方面炎症反应可以促进损伤修复。MC作为神经系统中的炎性细胞,在调控炎症反应方面发挥了重要作用。近些年发现AS也参与中枢神经系统的炎症反应,AS和MC通过“AS-MC串扰”调节细胞表型转化促进或者抑制炎症反应的发生[31]。AS在CIS后的炎症反应中发挥了重要作用。AS可通过产生TNF-α、IL-1等炎症因子,促进炎症反应发生,也可以分泌TGF-β、IL-10等抑炎因子抑制炎症反应。

细胞间黏附分子-1(ICAM-1)属于免疫球蛋白超家族成员,通过促进免疫细胞与组织之间的吸附,加速炎症反应发生。脑缺血时ICAM-1可以被TNF-α、IL-1β、INF等炎症因子诱导生成。NF-κB是一种重要的转录分子,能够促进炎症因子释放。脑缺血发生时AS大量增殖并表达ICAM-1和NF-κB,促进炎症反应。研究表明[32]“醒脑开窍”针法能够通过抑制炎症介质ICAM-1和MMP9的产生,发挥脑保护作用。另有研究表明[33]针刺能够通过抑制IL-6、TBF-α的表达以及抑制ICAM-1和血管细胞黏附分子-1的表达抑制脑出血后的炎症反应。

S100B蛋白属于钙结合蛋白S100家族。中枢神经系统中S100B蛋白广泛存在于神经胶质细胞中,可作为AS的标志物[34]。AS释放S100B蛋白与晚期糖化终产物受体(RAGE)相互结合,促进MAPK信号通路及其下游NF-κB信号通路的活化,促进炎症反应的发生。针刺能够下调AS的S100B蛋白表达,减少S100B蛋白与RAGE的结合从而减轻相关炎症反应[35]。

白细胞介素33(IL-33)属于IL-1家族成员,通过与辅助型T细胞2(Th2)上的ST2受体结合而发挥作用。IL-33能够促进T细胞向Th2型转变以及巨噬细胞(小胶质细胞)从M1型向M2型转化。而Th2和M2型MC都具有抑制炎症作用。研究表明,电针能够通过促进IL-33/ST2轴的激活,抑制AS和MC的活化,减轻大脑炎症反应,发挥了神经保护作用[36]。

三磷酸腺苷(ATP)作为细胞内的主要能源物质,在脑缺血发生后,由损伤神经元和胶质细胞释放到细胞外,细胞外ATP的升高会诱发一系列炎症反应发生。嘌呤受体作为ATP及其代谢产物二磷酸腺苷(ADP)的主要受体,在介导炎症反应方面发挥了重要作用。游小芳[37]通过免疫荧光双标法,观察嘌呤受体P2X7R和P2Y1R分别与AS标志物GFAP和MC标志物ED1共定位情况,结果表明,脑缺血促进嘌呤受体的表达及AS和MC的活化,针刺能抑制其表达和活化,针刺通过抑制P2X7R和P2Y1R的表达抑制炎症反应。

2.7 针刺对细胞通讯的调节

缝隙连接蛋白(CXs)是组成缝隙连接通道或半通道的细胞膜蛋白。半通道主要进行细胞与细胞外环境之间的信息交流,缝隙连接通道由相邻细胞膜之间的半通道组成,进行细胞间的信息交流。生理情况下,缝隙连接处于开放状态,半通道处于关闭状态。脑缺血损伤时会促进半通道的开放,致使细胞内外离子平衡破坏,加速细胞死亡。

CX43是AS缝隙连接的主要蛋白。Cx43可能通过促进细胞凋亡和线粒体自噬影响神经元的存活。针刺可以阻断Cx43的过表达,减轻脑神经元缺血再关注损伤。研究表明[38],针刺可以通过抑制mGluR5和P38MAPK mRNA的表达,调节 Cx43半通道的通透性,减轻脑缺血损伤。Cx43半通道是Ca2+进入细胞的重要途径,而细胞内Ca2+紊乱是脑缺血损伤的重要原因之一。研究表明[39],针刺能够通过抑制半通道的开放抑制细胞内钙超载,减少脑损伤。

2.8 针刺抑制脑水肿

水通道蛋白家族(AQPs)是一类主要负责水和小分子物质跨膜转运的膜蛋白。APQ4是该家族在中枢神经系统的主要成员,在AS大量表达。AS足突包绕血管,与血管内皮细胞、周细胞及神经元等共同组成神经血管单元(NVU),NVU作为一个完整的功能单位,在针刺治疗CIS中具有重要作用。AQP4在脑缺血时表达增多,是导致脑水肿的重要原因,针刺通过抑制AQP4表达,减轻脑水肿的发生。头针治疗可通过抑制V1AR/CaMK2/AQP4信号通路抑制CIS脑水肿[40]。AS中表达的另一种AQPs为AQP9,与脑水肿的发生密切相关。研究表明,针刺能够抑制AQP9的表达,减轻脑水肿的发生[41]。

2.9 针刺促进神经干细胞分化

NSCs是神经系统中能够自我更新并具多向分化潜能的细胞。成年人脑中NSCs主要存在两个区域,一个是侧脑室室管膜下区(SVZ),另一个是海马齿状回。脑缺血能够激活NSCs向神经元或胶质细胞分化。AS可能在NSCs增殖过程中起到促进或中介作用。研究表明[42],脑缺血后大鼠SVZ区GFAP表达增加,针刺治疗后GFAP进一步增加,提示AS的活化可能与NSCs在此处的增殖密切相关。同样,在对脑缺血大鼠海马齿状回的研究[43]表明,针刺能够通过调节AS活化促进神经发生及神经细胞的修复。

CIS发生后,部分RAS具有干细胞潜能,能够往神经元方向分化。通过荧光双标法分别用GFAP和神经元特异性烯醇化酶(NSE)标记大鼠海马AS和神经元,观察不同组别各时间点被标记细胞数量差异,结果显示,针刺治疗组较模型组GFAP和NSE双标细胞数量增多,NSE单标细胞数量增多,提示针刺可能促进RAS向神经元转化[44]。

巢蛋白(Nestin)属于中间丝蛋白,常作为NSCs的标志物。在RAS中发现有大量巢蛋白表达,进一步提示RAS可能具有多分化潜能。研究表明[45]针康治疗能够促进脑缺血大鼠巢蛋白的表达,促进NSCs增生。

波形蛋白(Vimentin)属于胶质细胞中间丝的成分之一,一般在胚胎期表达,出生后会很快被GFAP替代。波形蛋白也常作为NSCs的标志之一。近年研究发现,波形蛋白在脑损伤周围组织出现,Vimentin阳性表达与NSCs和RAS密切相关。研究表明[46],针刺治疗能够明显促进缺血皮质和纹状体Vimentin阳性细胞表达,改善大鼠神经功能缺损。Tao J等[47]研究表明,针刺曲池和足三里能够促缺血再灌注大鼠纹状体中GFAP/Nestin/Vimentin共标记阳性RAS的增殖,发挥中枢神经保护作用。

2.10 针刺抑制胶质瘢痕过度生成

脑缺血发生后,伴随AS活化,缺血周围区AS大量激活,胶质再生活跃,增生的神经胶质一方面能够抑制炎症扩散,减轻脑水肿及组织损伤,另一方面过度增生的神经胶质形成胶质瘢痕,抑制神经元的轴突再生,阻碍神经功能修复。硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)是一组以共价结合硫酸软骨素的蛋白质,属于细胞外基质分子家族成员。CSPGs是构成神经胶质瘢痕的重要成分,在中枢神经受损伤时,主要由AS生成。CSPGs通过抑制轴突伸展和侧枝萌发以及抑制层粘连蛋白的促轴突生长功能限制受损神经修复[48]。电针通过抑制CSPGs如神经蛋白聚糖和磷酸肌酸蛋白聚糖抑制胶质瘢痕的生成减轻脑缺血再灌注损伤[49]。

3 小结

AS作为中枢神经系统中具有广泛细胞组织联系与多功能的神经辅助细胞,在CIS发生发展过程中发挥了重要作用。针刺在CIS中对AS的整体调控表现在:抑制AS活化、促进AS增殖与抑制AS过度增生,有利于AS超微结构的稳定性。针刺治疗通过多途径双向调节AS相关机能,促进神经再生与修复、调控兴奋性氨基酸代谢、调节能量代谢、调控血管再生、抑制氧化及炎症反应、调节细胞通讯、抑制脑水肿、促进神经干细胞分化及抑制胶质瘢痕的过度生成等途径促进CIS损伤修复。

A1、A2型AS虽然已经提出,但是在脑缺血缺氧情况下对于单一表型的研究相对较少。在针刺刺激下的AS表型转化及相关物质代谢改变缺少详细研究。AS在脑缺血缺氧时的改变是一个动态的过程,对于不同时间阶段脑内AS相关物质代谢改变还不够确切,如果能够判别在不同时间阶段AS内代谢变化,选取最合适的干预时间及干预手段,诱导AS表型向着有利于疾病恢复的方向发展,将会是一个非常有价值的研究方向。针刺治疗的不同干预时间、干预方式以及不同的刺激参数对于疾病的影响也存在差异,针灸治疗脑卒中疗效显著并且有许多可以深入发掘的方向,希望随着研究的深入,未来会有更多研究出现,针刺治疗的干预方式会变得更加可控,针刺治疗疗效也会得到相应的提高。