3D 生物打印技术用于肝组织模型构建的研究进展

王晓东 汪恺 陈峻 徐骁

3D 生物打印技术作为组织工程领域最先进的技术之一，可用于制造生物替代物来替换或修复受损的组织和器官，现已在皮肤科、骨科、口腔科等学科中得到了应用[1]。肝脏作为人体最大的腺器官，结构复杂，功能多样，且相关疾病高发，在3D 生物打印技术研究中同样受到广泛关注。目前3D 生物打印技术已可以用于制造具有生物活性与部分功能的肝组织模型，在肝脏组织修复与再生研究中取得一定进展。这一技术的进步与肝脏相关疾病的治疗密切相关，有进一步实现临床转化的潜力。本文就该技术用于肝组织模型构建的相关研究进展作一综述。

1 3D 生物打印技术

3D 生物打印技术是在计算机辅助下，利用3D 打印机将细胞和由各类生物材料组成的“生物墨水”按特定空间排列组合，构建与目标组织或器官生物结构相似替代物的一种增材制造技术。该技术使得细胞与生物材料在空间内实现精确分布，再现目标组织或器官中复杂的三维结构与微环境，实现对目标组织或器官的高度复制[1-2]。因此3D 生物打印技术在组织与器官构建中具有很大应用潜力，是最有希望实现在体外制造人体器官的技术之一。根据构建功能性组织结构的不同工作原理，有着多种生物打印技术，如挤压式生物打印（extrusion bioprinting，EB）、光固化生物打印（stereolithography bioprinting，SLB）、喷墨生物打印（inkjet bioprinting，IJB）、激光辅助生物打印（laser-assisted bioprinting，LAB）等[3]。这些生物打印技术工艺各有优劣，可以单独或组合使用，以实现所需结构的制造。

2 生物墨水

负载细胞的生物墨水是3D 生物打印的基本原料，用于模仿组织中的细胞外基质，其能在打印过程中保护细胞，并在打印后为模型提供促进细胞生长和组织再生的支架[4]。为构建功能性组织模型，生物墨水应具有与目标组织细胞外基质相似的生化和生物特性，以维持细胞的正常生长和增殖[5]。此外，其还须具备可打印性、结构稳定性、生物相容性等特性，以满足生物打印需要。在模型构建中，研究者们还会根据需要在墨水中添加额外的生物活性成分，例如肝细胞生长因子、血管内皮生长因子等，以促进打印模型中的细胞增殖黏附、血管生成，进一步改善模型性能[6-7]。

天然高分子聚合物是肝组织模型打印中常见的生物墨水组分，其通常具有良好的生物相容性和降解性，能够满足3D 生物打印的要求[8]。目前常用的天然聚合物有胶原蛋白、明胶、海藻酸盐、纤维蛋白原、透明质酸等。除天然聚合物外，人造合成聚合物也是常用的打印原料，其具有较好的机械性能，能承受打印过程中和体内植入时的内外张力。常用的合成聚合物有聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨酯和聚己内酯等[9]。为实现对肝脏细胞外基质结构与成分更为精确的复制，越来越多的学者选择使用脱细胞基质（decellularized extracellular matrix，dECM）生物墨水来打印肝组织模型[10-11]。dECM 是通过去除组织中细胞成分制成的天然支架，具有其他材料难以模拟的原组织中细胞外基质的固有成分和独特结构，能通过再现组织特异性微环境来维持细胞活力和功能，促进组织生长发育，在生物打印应用中具有显著优势[12]。

生物墨水在肝组织模型构建中起着重要作用，目前对于生物墨水的研究已取得许多进展，包括开发出了各类含天然或合成组分的墨水，以及性能更为优越的dECM 墨水。但由于肝脏结构复杂，传统生物墨水在可打印性和生物相容性等方面仍存在不足。为构建具有高保真度的肝组织模型，未来有必要进一步开发高黏度、高生物相容性的多组分生物墨水。在改善生物墨水生化特性方面，对于生物墨水添加剂的研究也需要进一步加强。这需要研究者不断完善生物墨水的设计与材料选择，加强与其他学科的交流合作。

3 3D 生物打印肝组织模型的构建与应用

由于3D 生物打印技术具有快速精确制造出高保真度组织模型的能力，利用该技术打印的肝组织模型较传统二维细胞培养模型具有更好的细胞存活与功能维持[13]，这为肝脏组织工程的发展带来了新希望。因此，3D 生物打印技术被越来越多地用于再生医学研究，以期制造出能够长期保持活力与功能的肝组织模型[14]，用于治疗各种因素导致的肝脏损伤。

3.1 肝组织模型的细胞来源 肝脏主要由肝实质细胞和非实质细胞组成。肝实质细胞主要是肝细胞、胆管细胞，承担肝脏的主要功能，而非实质细胞则包括Kupffer 细胞、肝窦内皮细胞和肝星状细胞等，起连接和支持肝实质细胞的作用。肝组织模型的成功构建首先需要解决细胞来源的问题。

原代肝细胞是直接从肝脏中分离出来的肝细胞，具有较高体外代谢活性，是生物打印肝组织模型最理想的细胞来源之一[15-16]。然而原代肝细胞数量有限，难以分离且增殖能力差、体外功能退化快，对于其获取与培养仍存在困难[17]。此外一些肝癌来源的细胞系，如HUH7、HepG2 和HepaRG 等[18-20]，可以发挥白蛋白分泌、尿素合成等多种肝细胞功能，被作为一种替代选择而广泛用于肝组织模型的构建。在其他研究中，一些诱导的肝细胞样细胞（hepatocyte-like cells，HLCs）也被用于3D 生物打印，如从人脂肪干细胞分化的HLCs[21]，从人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）、胚胎干细胞衍生的肝细胞等[22]，这类细胞可以从人自体取材，具有开发个体化模型的优势，但需要关注细胞的转录特性和生物活性方面的差异。不同于肝细胞的来源多样，胆管细胞与各类非实质细胞多直接与肝细胞进行共打印来构建肝组织模型。此外，在一些研究中，也有学者使用其他细胞来替代肝非实质细胞，例如人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）可以替代肝窦内皮细胞，用于肝组织模型中血管的构建[23-24]。另一方面，随着干细胞培养和定向诱导分化技术的进步，越来越多的研究开始选择利用干细胞分化来获得各类肝非实质细胞[25]。

3.2 肝内脉管结构的构建

3.2.1 肝内血管 血管构建对于肝内微环境的建立、肝功能的维持以及移植物体内的长期生存至关重要。为构建血管化打印模型，研究人员已提出多种方法，包括将生长因子掺入打印结构来诱导血管生成，在结构中植入内皮细胞以刺激血管生成，或使用各种微加工技术在模型中构建多尺度微流体通道来制造血管等[26-27]。

在肝内血管构建中，Kang 等[28]通过EB 技术将含肝细胞、内皮细胞的生物墨水与牺牲材料海藻酸盐进行共打印，构建以海藻酸盐为牺牲骨架的模型，再通过调节温度除去海藻酸盐，形成由内皮细胞覆盖的管腔，用以代表肝内血管，实现模型中血管系统的构建。Liu 等[23]则使用甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）和纤维蛋白混合物制成载细胞墨水，用于封装HUVECs、间充质干细胞和HepG2 细胞来构建肝组织模型，实验中HUVECs、间充质干细胞能在打印模型中形成良好的3D 毛细血管网络。为实现进一步的血管仿真，Gao 等[29]使用含有血管组织细胞外基质成分的生物墨水来负载HUVECs，结合同轴细胞打印技术成功构建出体外血管模型，该模型具有选择性通透、抗血小板黏附等多种血管生理功能与特点，在血管化肝组织模型的构建中具有良好应用前景。除人工构建肝内血管外，也有研究发现在一些打印模型中能自发形成功能性血管网络[20]，证明3D 生物打印能模拟出促进血管生成的微环境。

3.2.2 肝内胆管 肝组织模型中胆管的构建是另一项重大挑战，3D 生物打印技术同样在模拟胆管结构的构建中发挥作用，有学者使用立体光刻打印技术将大鼠胆管细胞封装到3D 水凝胶结构中，引导它们形成分支管状网络。实验中，这些大鼠胆管细胞可以增殖、迁移并组成具有预定几何结构的胆道分支网络，实现对肝内胆管的复制[30]。Lewis 等[31]则采用牺牲材料泊洛沙姆打印出具有特定几何形状的胆管样结构，然后将承载胆管细胞的水凝胶共打印到该结构内壁，再通过降温将泊洛沙姆液化洗去，最终成功构建出形状可控的3D 肝内胆管模型，为未来人体肝组织模型中胆管的打印提供基础。

目前肝内胆管的构建已取得一定进展，但仍有许多问题需要解决，例如胆管打印细胞和生物材料的选择以及打印后胆管活力与功能的维持等。此外，为在未来的移植过程中实现有效的供受体胆管吻合，还需进一步提高打印胆管的仿真度与结构稳定性，这需要研究人员不断提升3D 生物打印的多组织构建能力以及优化改进各类生物墨水。

3.3 肝组织模型构建 实现功能化模型构建是生物3D 打印的重要目标。最初，研究者们进行了体外肝组织模型的打印与功能研究。Wu 等[19]使用海藻酸盐、纤维素纳米晶体和GelMA 配制生物墨水来封装HepG2细胞和小鼠胚胎成纤维细胞，在实验中运用EB 技术成功将其打印成一种模拟肝小叶结构的蜂窝状组织模型。这一模型实现了两种细胞的共培养，增加了细胞间的相互作用，有利于细胞的生长与功能维持，在模型培养中观察到了白蛋白产生增多，为功能性肝组织模型的生物打印提供了基础。Cui 等[32]则以GelMA水凝胶为基质，共打印肝细胞和成纤维细胞来构建肝小叶状微模块，并通过非接触微操作技术组装微模块来创建更大的小叶状微组织，进一步改善组织的结构完整性。实验中该微组织能发挥白蛋白分泌和尿素合成等功能，且在培养1 周后仍能维持90%以上细胞活性，展现出3D 生物打印在功能性肝组织再造中的巨大应用潜力。

此外，也有学者选择使用干细胞来构建肝组织模型[33]。Faulkner-Jones 等[22]利用阀门式生物打印技术打印出了含有hiPSCs 和人胚胎干细胞的生物组织。这些细胞在打印后可以分化成与肝细胞形态与功能类似的HLCs，且细胞活力和分化能力几乎不受打印影响。这首次表明hiPSCs 具有生物打印的潜力，为未来生产复杂器官提供可能。为进一步提高打印模型存活率，Goulart 等[13]尝试将hiPSCs 衍生的HLCs 与各类非实质细胞先团聚成细胞球体，再运用EB 技术构建出肝组织模型，实验中该球体打印模型在培养18 d 后仍能保持80%细胞活性，而非球体打印模型此时仅能维持60%细胞活性，且肝组织代谢功能远低于球体打印模型。Goulart[34]还进一步将hiPSCs 衍生的HLCs 与间充质细胞和内皮细胞等细胞结合，使用3D 生物打印技术成功制造出结构与功能稳定的肝移植物。除肝细胞外，干细胞还能定向分化为各种其他肝内细胞，包括肝窦内皮细胞，肝星状细胞和Kupffer 细胞等[25]，用于构建更为仿生的肝组织模型。

综上所述，在体外肝组织模型的构建中，研究者们已尝试使用各类细胞构建出了多种打印模型。虽然相关模型与正常人体肝组织相比还有很大差距，但在体外实验中皆被证实能维持一定时间的活力与功能，这为之后更为仿生的肝组织模型构建与体内移植提供了基础。

3.4 基于3D 生物打印的肝损伤修复 为进一步研究生物打印肝组织模型能否在体内发挥功能，起到肝损伤修复的作用，许多学者进行了相关的动物实验。Kang 等[35]将生物打印肝组织模型植入药物诱导的肝衰竭小鼠网膜之中，发现植入小鼠体内的模型较体外培养生长得更快，白蛋白的表达水平也更高。Yang 等[20]则根据特定的打印程序，使用HepaRG 细胞构建3D 生物打印的肝类器官模型。这一模型在体外诱导肝向分化后被植入到肝衰竭小鼠体内，在植入2 周后发现模型内自发形成功能性血管。植入4 周后，小鼠体内胆红素及肝酶水平显著降低并获得了人类肝脏特有的药物代谢功能，且该打印模型的植入显著提高了肝衰竭小鼠的存活率。上述动物研究表明3D 生物打印肝组织应用于移植以治疗严重肝病的可能。

除各类肝病以外，在临床中，创伤、手术切除等问题同样能造成肝脏的严重损伤，且这些问题所导致的肝脏缺损在几何形态上往往是随机的，难以与预制的结构模型匹配。在肝脏损伤严重的情况下，外部干预对促进肝脏再生至关重要。其中原位生物打印为损伤肝脏的再生修复提供了新途径，其通过在缺陷处植入生物材料支架，提供人工微环境与结构支持，来促进肝组织形成，避免了体外模型构建的麻烦与不足[36]。Yang 等[37]通过磁控3D 生物打印技术在肝切大鼠模型中制备具有电活性与自愈性的生物水凝胶支架，实验中可显著促进肝组织再生，实现肝损伤修复与肝功能维持。

上述研究表明，基于3D 生物打印技术所构建肝组织模型或生物支架能用于治疗各类肝脏损伤。虽然相关研究目前尚处于起始阶段，离最终的临床应用还有很长的路要走。但不可否认该技术在人体肝损伤修复中具有巨大应用潜力，未来有望实现进一步的临床转化，为各类肝脏疾病的治疗提供重要帮助。

4 局限与挑战

3D 生物打印作为一项快速发展的前沿技术，在肝组织模型构建中已取得了不少可喜的成果，但其同样面临诸多问题与挑战。首先，在打印前的材料选择方面，为实现模型的体内移植，需要解决各类打印材料在受体内的相容性、毒性、降解率以及宿主免疫系统的排斥反应等问题。其次，对于合适打印细胞的选择同样存在挑战，各类细胞需要符合打印要求，且要有稳定的细胞来源。

在肝组织模型构建中，受限于当前打印技术的精度与分辨率，人们仍无法完全精确重建肝组织的微结构，且血管、胆管等重要功能性结构的构建及整合还存在不足，这必然会影响打印模型功能的发挥[33]。此外，目前打印模型的力学性能通常较差，缺乏足够的机械强度及结构稳定性，需要对模型性能进行改进。且目前构建的肝组织模型与可供移植的肝脏相比尺寸偏小，未来需要进一步扩大模型尺寸。这有望通过模块化组织工程来实现，即组装成熟的3D 生物打印功能单元以构建大尺寸的组织模型[38-39]。

在成功打印出模型后，细胞活性与功能的维持则是研究者们需要关注的重点，如果打印后细胞存活率很低，将无法实现目标组织的功能。而在目前的生物打印过程中，由于需要使用各种光、热、气体等刺激，不可避免地会对细胞的活性产生不确定的影响[40]。此外，打印肝组织模型时可能会用到各类干细胞，由它们所分化形成的肝细胞可能与正常肝细胞存在生物活性与功能方面的差异[41]。因此，研究者们还需要优化改进各类生物打印工艺，并筛选合适打印细胞与生物墨水。

5 展望

目前，3D 生物打印技术仍处于发展的初级阶段，所构建的肝组织模型只进行了少量的动物体内移植实验，离完整人体肝脏再造与移植仍有很长距离。为提高打印模型的质量，实现最终的临床转化，未来的研究需要集中于开发具有更好生物性能和打印保真度的生物材料，以及寻找能够满足打印需求的合适细胞。展望未来，随着材料科学、生物工程和计算机科学等相关学科的不断发展，以及新型生物墨水的开发和理想生物打印方法的使用，3D 生物打印技术有望用于构建具有活力与功能的生物人工肝脏，在肝脏再生研究与肝脏疾病治疗中发挥重要作用。