青少年特发性脊柱侧凸进展风险的表观遗传学因素研究进展*

刘小梅,王艳洋,刘 敏,王 谦

(四川大学华西医院康复医学中心,成都 610041)

青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)是一种复杂的脊柱三维结构改变,多见于10岁至骨骼发育成熟的儿童,发病率为0.47%～5.20%[1]。AIS的病因尚不明确,但目前普遍认为它是一种由遗传因素和环境因素共同作用的多基因疾病[2-3],治疗目标主要以控制侧凸进展,避免后期手术为主[4]。虽然支具治疗的有效性已得到证实[5-6],但治疗效果存在很大异质性,部分患者即使经过严格的支具治疗,侧凸仍然进展并达到手术阈值[7-8]。准确预测侧凸进展风险将有助于医生及治疗师对AIS患者进行风险分级,评估患者预后,提供更加个性化的治疗方案[9]。临床上常用的进展风险因素主要包括剩余生长潜能、侧凸大小、侧凸类型等[10-11],并基于此开发了多种预测模型,但灵敏度和特异度有限[12-14]。近年全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)促进了AIS候选基因的鉴定,并确定了多组与AIS进展相关的基因[15-17],但在后续的多种族复制研究中并不成功[18-19],这也使得它的预测价值十分有限。同卵双胞胎AIS患者侧凸进展的差异性表明环境因素可能通过表观遗传变化导致AIS的进展,这在后续的研究中得到证实[20-21]。表观遗传学标志物在预测AIS进展风险方面的价值开始受到越来越多的关注。

表观遗传学标志物主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA(如 miRNA)[22],这些标志物通过引起局部染色质重塑,改变调控元件对基因的可及性,进而在染色质水平动态调控基因的表达,但并不改变基因序列[23]。表观遗传学因素可稳定地反映遗传因素及环境暴露之间的相互作用,在预测侧凸进展方面显示出更多优势[24-25],同时它可以识别患者对干预治疗的反应[26],在精准医疗、个性化医疗方面拥有巨大潜力。本文将对AIS进展风险的表观遗传学因素的研究进展进行综述,以期为后续AIS的治疗及研究提供思路。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是最常见的表观遗传机制,其通过招募参与基因抑制的蛋白质或抑制转录因子与DNA结合来调节基因表达[27]。甲基与CpG二核苷酸共价结合,在常规DNA提取过程中不会丢失,因此是非常适合用于大规模流行病学研究的表观遗传标志,这为利用现有DNA生物标志物来发现复杂疾病的表观遗传风险因素开辟了更多可能性[28]。目前的研究表明一些DNA区域的低甲基化及部分基因启动子的高甲基化都与AIS进展有关。

1.1 DNA区域的低甲基化

侧凸角度的增加与一些DNA区域的甲基化减少有关,特定基因的甲基化可以作为疾病诊断筛查和预后预测的生物标志物。2018年,MENG等[29]首次使用全基因组方法确定了DNA甲基化在预测AIS进展方面的潜力。MENG等首先对两对侧凸进展不同的同卵双胞胎AIS患者进行了表观遗传学基因组分析,发现他们的DNA甲基化水平存在明显差异,进展组的血液样本中cg01374129的甲基化水平明显低于非进展组。然后,MENG等分析了其他进展不同的AIS患者,得到了相同的结果。DNA甲基化差异与侧凸进展呈现明显的相关性,并且不受遗传差异的影响,因此MENG等认为位点cg01374129的低甲基化水平是侧凸进展高风险的独立预测因素。另一项研究分析了8对同卵双胞胎AIS患者(其中6对侧凸进展不同,2对侧凸进展相同)的全基因组甲基化水平,确定了4个与侧凸严重程度相关的CpG位点(cg02477677、cg12922161、cg08826461、cg16382077),侧凸严重程度的增加往往与这些位点甲基化水平降低有关,同时侧凸严重程度的差异与双胞胎之间的甲基化差异呈正相关或负相关[20]。后续研究还报道了AIS患者两侧深层椎旁肌和背部浅层肌肉中雌激素受体1基因(estrogen receptor 1 gene,ESR1)的组织依赖区域和差异甲基化区域(tissue dependent and differentially methylated regions,T-DMRs)的甲基化水平,发现在大多数T-DMR2 CpG中甲基化水平与侧凸凹侧的ESR1表达水平相关,在Cobb角≤70°患者的4个CpG位点上,侧凸凹侧深部椎旁肌的T-DMR2甲基化水平明显降低,这提示T-DMR2甲基化的差异可能与AIS的严重程度有关[30]。这些研究结果表明,一些DNA区域的甲基化差异与侧凸的严重程度及进展相关,DNA区域的低甲基化水平是侧凸进展风险的有效预测因素。

1.2 基因启动子的高甲基化

基因启动子甲基化与基因表达密切相关,在基因表达中起重要作用,基因启动子可通过调节其甲基化水平来调控基因的表达[31]。近年来的研究发现基因启动子的高甲基化与AIS的进展及其严重程度密切相关。MAO等[32]研究发现AIS患者血清中的软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)基因表达明显降低,而COMP的启动子甲基化与基因表达密切相关。他们评估了50例AIS患者和50例健康对照者COMP启动子的甲基化水平,发现AIS患者的COMP启动子甲基化水平明显升高,且与Cobb角和实际年龄明显相关。COMP启动子的甲基化水平越高,则患者的主弯Cobb角越大、发病年龄越早、侧凸进展的风险也更高。COMP是一种细胞外基质(extracellular matrix,ECM)糖蛋白,影响胶原蛋白的组装和ECM的稳定性。COMP突变会引起内质网应激和软骨细胞凋亡,导致罕见的骨骼疾病[33-34]。这也提示COMP通过调节其启动子的甲基化水平,调控基因表达,进而参与脊柱侧凸的进展。另一项研究发现AIS患者的PITX1启动子甲基化水平与侧凸进展和侧凸严重程度明显相关,在Cobb角>30°的AIS患者中,PITX1启动子甲基化水平明显升高,而PITX1基因表达降低[28]。作者在后续的研究中还发现AIS患者PCDH10启动子甲基化的平均水平高于健康对照组,而基因表达水平明显低于健康对照组,两者呈明显负相关。同时,PCDH10启动子甲基化水平与主弯Cobb角呈正相关,PCDH10甲基化水平越高,主弯Cobb角越大,这提示PCDH10启动子甲基化异常与AIS的进展有关[35]。

LBX1是一个在发育过程中起着重要作用的同源盒基因。既往研究表明,LBX1在骨骼肌组织中高表达,并在出生后的中枢神经系统和骨骼肌发育期间具有特定的调控表达模式[36-37]。最近的表观遗传学研究,为LBX1在AIS进展中的作用提供了新的证据。JANUSZ等[38]对57例AIS患者和20例非AIS患者的深层椎旁肌中LBX1启动子区甲基化水平进行了检测,以分析其与AIS发生及严重程度的相关性。结果显示,除一个CpG位点外,AIS患者与非AIS患者之间的椎旁肌LBX1甲基化水平无明显差异,而对比主弯Cobb角≤70°及Cobb角>70°的患者椎旁肌的LBX1启动子区甲基化水平显示,主弯Cobb角>70°的患者侧凸凸侧的反向链启动子区的23个CpG序列中,有17个CpG位点甲基化水平明显升高。因此JANUSZ等认为LBX1启动子甲基化水平与AIS的发生无相关性,但与AIS的严重程度之间存在关联。在严重的AIS患者中,凸侧深层椎旁肌LBX1启动子区域甲基化水平的不对称性表达揭示了局部作用因素在AIS进展中的作用。

2 miRNA过表达

miRNA是微小非编码RNA,广泛存在于生物液体中,易于提取且其图谱在长期临床研究中相对稳定,是研究AIS的潜在生物标志物。miRNA参与了许多可以在表观遗传学上调节细胞发育和分化的生物过程。研究表明miRNA与骨骼代谢、成骨细胞、破骨细胞的分化密切相关,成骨细胞和破骨细胞的稳态失衡将影响骨细胞的形成、吸收及骨化,改变骨骼的机械强度[39]。因此,在脊柱成熟过程中保持骨代谢的最佳分子调控状态十分重要。在AIS患者的成骨细胞和破骨细胞分化过程中,miRNA介导的信号传导失衡,将改变骨形成和吸收的正确稳态,从而影响AIS患者的脊柱机械内环境,改变侧凸的进程[40]。ZHANG等[41]通过分析AIS患者和对照组的骨活检组织及来自这些样本的原代成骨细胞,发现miR-145是一个潜在的干扰成骨细胞和骨细胞功能的上游调控因子,miR-145和β-catenin mRNA(CTNNB1)在AIS骨组织和原代成骨细胞中过表达,且两者表达呈正相关。同时miR-145与血清硬化素、骨桥蛋白和骨保护素之间呈明显负相关,通过敲除miR-145可下调β-catenin的表达及转录活性从而恢复受损的骨细胞活性。ZHANG等指出AIS患者miRNA异常表达及其对骨细胞功能的影响,可能导致AIS患者的骨量减少,而骨密度低被认为是AIS进展风险的独立预测因素[42],因此建议将miR-145作为AIS预后评估的生物标志物。另一些研究对重度和轻度AIS患者及健康对照组的血浆样本进行了miRNA表达谱分析,发现miR-151a-3p在重度AIS患者中过表达,而在患者原代成骨细胞中GREM1的表达降低,研究者认为miR-151a-3p过表达可能通过抑制成骨细胞中GREM1的表达来中断骨稳态,从而促进脊柱侧凸的进展,建议将其作为AIS预后的生物标志物[43]。

AIS椎旁肌凹凸侧的运动单位电位振幅差异、凹凸侧Ⅰ型纤维的比例失衡、肌肉体积和脂肪浸润失衡、AIS两侧椎旁肌中褪黑素受体和转化生长因子信号通路的不对称表达等都表明椎旁肌可能在AIS的发生和进展中发挥重要作用[44]。有研究发现遗传及环境因素通过影响表观遗传学基因组和椎旁肌的转录变化破坏脊柱的稳定性,影响侧凸的进展。JIANG等[44]对5例AIS患者的5对椎旁肌进行RNA测序发现,ADIPOQ和H19在椎旁肌两侧存在明显表达差异,凹侧肌中H19表达水平相对较低、ADIPOQ表达水平较高、较大的侧凸角度与发病年龄较小有关。JIANG等鉴定了由H19编码的miR-675-5p是AIS中ADIPOQ表达的调控因子,miR-675-5p在AIS患者的凸侧肌肉组织中高表达,其表达水平与H19呈正相关,与ADIPOQ呈负相关。miR-675-5p高表达可下调ADIPOQ的表达水平,而凸侧肌肉中较低的ADIPOQ水平可能会导致凸侧的椎旁肌无力,进而加速侧凸的进展。

ZHANG等[25]在传统预测模型的基础上,引入表观遗传风险因素建立了一个新型复合逻辑回归模型,以预测AIS进展高风险患者。在首次就诊时收集患者最大Cobb角、初潮状态、体重、Risser征并测量外周血中miR-145和P1NP的水平,再通过复合模型计算风险评分,当风险评分临界值设置为0.2分时,其预测的灵敏度为91.7%,特异度为79.8%,灵敏度和特异度都远高于传统预测模型[45]。另外ZHANG等还计算了基础危险比,初次就诊时风险评分≥0.2分的患者与<0.2分的患者相比,进展为Cobb角>40°的风险高出27.9倍。这种新型预测模型在为医生及治疗师提供临床决策参考,帮助进展高风险患者及时进行支具治疗,同时避免进展低风险患者的过度医疗方面显示出巨大潜力。

3 小 结

表观遗传学的发展为AIS进展风险因素的研究提供了新的方向。正如AIS一样,遗传及环境因素共同作用影响着脊柱侧凸的进展,同卵双胞胎脊柱侧凸进展差异性的研究使人们更加确信表观遗传学因素在AIS进展中发挥重要作用。目前的研究结果显示:一些DNA区域的低甲基化、基因启动子的高甲基化和miRNA的过表达都与AIS的进展有关,这些研究结果有望为AIS的诊疗及预后提供更多参考。但目前的相关研究仍然较少,虽然组蛋白修饰也是经典的表观遗传学机制之一,但作者检索文献后并未找到组蛋白修饰在AIS进展方面的研究,因此未对这部分内容进行综述。与此同时关于非编码RNA的研究也较少,主要集中miRNA上,研究涉及样本量均较少并且研究主要集中在外周血和侧凸两侧椎旁肌的分析上。外周血虽然易于提取,但是特异度较差;而椎旁肌虽然拥有了较高的特异度,但是很难寻找健康对照,这些局限性将限制表观遗传因素在预测AIS进展中的可信度及实用价值。因此,对于AIS进展风险的评估仍然需要结合多种因素综合考虑,同时未来还需要更多高质量的研究探讨表观遗传学因素在AIS诊疗及预后中的应用价值。