噬菌体裂解酶基因Lys BT1在普通小球藻中的表达

束忠涛 王冉 沈元朝 张汉泽 朱树娇 王姝璇 孙利厂

摘要：噬菌体裂解酶因高效、安全的殺菌特性成为潜在的抗菌药物，并受到广泛关注。本试验在前期通过基因表达制备高效噬菌体裂解酶Lys BT1的基础上，深度解析Lys BT1与细菌上裂解酶受体相互作用的结构特点，成功构建出质粒pCAMBIA 1301-BT1。将该质粒通过电转化的方式导入普通小球藻中，电转条件为：电场强度1.5 kV、脉冲距离2 mm、脉冲时间0.2 ms，瞬时表达后成功进行了活性测定，从而验证了普通小球藻作为裂解酶表达载体的可行性，为噬菌体裂解酶的表达系统研发提供了一条可行路径。

关键词：噬菌体裂解酶；小球藻;电转化；抗菌药物

中图分类号：Q939.48文献标识码：A文章编号：1000-4440（2024）04-0734-06

Expression of bacteriophage lyase gene Lys BT1 in Chlorella vulgaris

SHU Zhong-tao1，2，WANG Ran2，SHEN Yuan-chao2，ZHANG Han-ze1，2，ZHU Shu-jiao2，WANG Shu-xuan2，SUN Li-chang2

（1.School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China;2.Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：Bacteriophage lyase has become a potential antibacterial drug due to its high efficiency and safe bactericidal properties， and has been widely concerned. In this study， based on the preparation of high-efficiency bacteriophage lyase Lys BT1 by gene expression in the early stage， we deeply analyzed the structural characteristics of Lys BT1 interacting with the lyase receptor on bacteria， and successfully constructed the plasmid pCAMBIA 1301-BT1. The plasmid was introduced into Chlorella vulgaris by electrotransformation. The electrotransformation conditions were as follows： electric field intensity of 1.5 kV， pulse distance of 2 mm， and pulse time of 0.2 ms. After transient expression， the activity determination was successfully carried out. Therefore， the feasibility of Chlorella vulgaris as a lyase expression vector was verified， which provided a feasible path for the development of bacteriophage lyase expression system.

Key words：bacteriophage lyase;Chlorella vulgaris;electrotransformation

噬菌体裂解酶（Bacteriophage lyase）现已在多个领域显示其优越性和独特性，有望成为后抗生素时代控制食源性致病菌、腐败菌，保障食品安全的有效杀菌剂[1]。目前使用较多的外源表达系统主要有大肠杆菌[2]和酵母[3]等，但这些表达系统仍存在安全性不高、易污染、表达量低等问题。基因工程植物具有不同于培养细胞的性能特征，如光合生长和易于分级，然而，由于繁琐的遗传方法、缓慢的生长速度、较低的产量以及监管方面的限制等，其发展潜力还没有得到充分实现。微藻的生长条件要求简单，且微藻具备植物基因组转录后翻译处理能力，同时微藻具备微生物快速生长和高密度培养特性[4]。目前作为表达载体的微藻有莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）[5]、杜氏盐藻（Dunaliella salina）[6]、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）[7]、普通小球藻（Chlorella vulgaris）[8]等。

普通小球藻是小球藻中目前最广泛培养的藻种之一[9]，富含蛋白质和各种其他营养物质，蛋白质含量超过50%[10]，具有重要的商业价值，也是目前研究和认证的人类食品之一[11]。因其生长速度快、易培养和可塑性强的特性，常被作为外源基因表达平台的首选。Hawkins和Nakamura[12]1999年使用PEG转化法将人生长激素基因（hGH）在普通小球藻中成功进行了瞬时表达。Koo等[13]采用电击法将牛乳铁蛋白N-端肽段成功在普通小球藻中获得表达。Ng等[14]通过农杆菌介导的方法在普通小球藻中成功诱导表达YoeBSpn-GFP和PezT-GFP融合基因，并测试了其致病性。Shin[8]2020年在氮缺失的条件下成功诱导表达获得hG-cSf多肽。

本试验在前期表达制备高效噬菌体裂解酶LysBT1（广谱噬菌体裂解酶）的基础上，采用噬菌体基因组深度解析及高分辨率X射线晶体和冷冻电镜技术，深度解析裂解酶Lys BT1与细菌上裂解酶受体互作的酶活性结构特点、决定裂解谱的关键结构、酶结构功能的鉴定与预测。针对超级耐药细菌宽谱裂解酶的设计，本研究以细菌上裂解酶的受体为靶标，基于酶结构的分子改良、修饰和裂解酶活性中心定向设计，研制出对耐药菌的宽谱裂解酶，并提高裂解酶的稳定性和抑菌活性;通过CRISPR定点基因编辑技术在普通小球藻中进行基因改造，成功构建质粒pCAMBIA 1301-BT1，并在普通小球藻中完成表达。

1材料及方法

1.1试验材料

普通小球藻、TreliefTM5α感受态细胞、大肠杆菌ATCC 25922等均由笔者所在实验室保存;高纯度质粒DNA小量提取试剂盒购自北京擎科生物科技股份有限公司;LB肉汤培养基购自BD Difco公司。

1.2试验方法

1.2.1藻种的培养和生长曲线的测定将对数生长末期的小球藻培养液按10％的接种量接入装有50 ml培养基的150 ml锥形瓶中，置于光照培养箱中静置培养。培养条件为：光照度2 640 lx，湿度72%，光/暗周期12 h/12 h，培养温度为（28.0±0.5） ℃。定期测定藻液560 nm处的吸光度（OD），检测小球藻的生长速度。

1.2.2质粒构建参照本研究室前期方法[15]进行试验。裂解酶基因克隆及表达载体构建方法如下：首先，提取噬菌体V-EcoM-C1 的基因组，然后以其为模板、以Lys BT1-F、Lys BT1-R为引物扩增噬菌体裂解酶基因。扩增程序：预变性温度95 ℃，持续5 min;变性温度95 ℃，持续30 s，退火温度62 ℃，持续30 s，延伸温度72 ℃，持续1 min，共30个循环;最后延伸温度72 ℃，持续10 min。回收目的片段后用EcoRⅠ和 NotⅠ进行双酶切。将双酶切后的目的片段连接至经Eco RⅠ和NotⅠ双酶切后的pCAMBIA 1301载体，再将构建好的重组质粒pCAMBIA 1301-BT1转化至TreliefTM5α感受态细胞中，筛选阳性克隆并测序验证表达载体pCAMBIA 1301-BT1。

1.2.3重组克隆转化取两支100 μl冰上融化的TreliefTM5α感受态细胞，分别加入10 μl构建好的重组质粒pCAMBIA 1301-BT1，温和吹打混匀后转移至冰上，静置30 min;在42 ℃水浴锅中热激45～60 s，然后迅速转移至冰浴中，静置2 min。向离心管中加入700 μl无抗性LB培养液，37 ℃ 200 r/min复苏60 min，再吸取80 μl复苏液均匀涂布到含有50 μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，将平板倒置放于37 ℃培养箱中过夜培养，在10 ml的EP管中加入5 ml的LB培养基，挑取抗性平板上的单菌落在培养基中搅拌，过夜培养。

1.2.4质粒的提取及验证采用北京擎科生物科技股份有限公司高纯度质粒DNA小量提取试剂盒提取，并进行核酸验证。

1.2.5瞬时转化取对数生长期的小球藻，稀释含量梯度至1×108左右;取藻液3～5 ml用BG11洗涤3次，5 000 r/min 5 min;加入山梨醇和甘露醇各100 μl;3 000 r/min离心5 min收集菌体，加入HEPES缓冲液（2.38 g溶于9 ml）混匀，提前用PE紫外灯处理电转杯（注意是否吹干），预冷备用，将电转杯冰浴30 min后放入电击转化仪中进行电击转化，电场强度为1.5 kV，脉冲距离2 mm，脉冲时间为0.2 ms，立即加入100 μl预冷的BG11液体培养基，将混合液转入无菌离心管中，再加入0.9 ml BG11培养基，然后在光照条件下恢复培养48 h。

1.2.6荧光显微镜镜检取20 μl恢复后的藻液在荧光显微镜下观察。在无光和有光两种不同条件下观察、对比荧光显微镜下的小球藻。

1.2.7噬菌体裂解酶活性测定将恢复24 h后的小球藻放入离心机中按12 000 r/min离心2 min，收集上清液。将沉淀的藻体用BG11悬浮，再放入超声波破碎仪中按 300 W 15 min破碎，离心收集上清液。通过点样双层（底层为1.2% LB，上层为0.6% LB和菌液的混合物）方式检验上清液中酶的活性，本次所选菌株为大肠杆菌ATCC 25922。

1.2.8最小抑菌浓度测定将ATCC 25922以挑取单菌落的方式接种于LB液体培养基中，培养4～6 h至对数期，用PBS洗涤3次，调整至OD600为0.6，再用LB培养基按照1∶100稀释后备用。将分离、纯化、浓缩后的噬菌体裂解酶质量浓度调整至512 μg/ml，在96孔板前3排的第1列加入200 μl裂解酶，第2～12列各加入100 μl PBS，从第1孔吸取100 μl裂解酶依次向后倍比稀释至第10孔，1～11孔添加100 μl稀释后的菌液，12孔加100 μl LB。每梯度裂解酶濃度设置3组对照，并设置空白对照和阳性对照，在37 ℃培养箱中静置培养24 h，以完全不生长细菌的裂解酶质量浓度为最小抑菌浓度。

2结果与分析

2.1小球藻的生长曲线

按10%的接种量培养，培养21 d，如图1所示，在培养的第14～15 d生长速率达到最快，认为此期处于对数生长期。

2.2表达的阳性克隆筛选

正常的TreliefTM5α感受态细胞对卡那霉素敏感，在培养基中无法生长，只有携带重组质粒pCAMBIA 1301-BT1的TreliefTM5α感受态细胞能成功在卡那霉素抗性培养基中生长，图2显示，在含卡那霉素培养基（100 μg/ml）上有单菌落生长，因此可以推断，重组质粒pCAMBIA 1301-BT1在TreliefTM5α感受态细胞中转染成功。

2.3陽性克隆的核酸分析

试验通过提取过夜培养的TreliefTM5α感受态细胞DNA做电泳，从图3可以看出试验组在12 000 bp附近有条带，与拟转染的噬菌体裂解酶相对分子质量相符。

2.4转染后小球藻的荧光反应

以转入质粒的小球藻作为试验组，未导入质粒的小球藻作为空白对照组，将两组小球藻在白光和激发光的条件下于荧光显微镜下观察，在白光条件下，两组均能看到清晰藻体;在激发光条件下，试验组有明显的红色荧光，而对照组一片黑暗（图4）。重组质粒pCAMBIA 1301-BT1有荧光标签，故推断试验组成功表达了质粒pCAMBIA 1301-BT1。

2.5噬菌体裂解酶的活性

取适量成功转染阳性的小球藻液，离心分离藻液上清液和小球藻破碎后上清液来检测小球藻表达的噬菌体裂解酶的活性。如图5所示，离心分离藻液的上清液对大肠杆菌ATCC 25922无明显的杀菌效果，小球藻破碎后离心后的上清液对大肠杆菌ATCC 25922有良好的杀菌效果。试验结果表明，小球藻系统表达的噬菌体裂解酶能成功裂解致病菌，且该裂解酶杀菌活性良好。

2.6噬菌体裂解酶的最小抑菌质量浓度

如图6所示，质量浓度在32 μg/ml时有明显分界点，在大于该质量浓度时有明显的抑菌效果，小于该质量浓度时则抑菌效果较差，由此得出最小抑菌质量浓度为32 μg/ml。

3讨论

自从科研人员首次尝试在小球藻中表达异源蛋白质以来，相关研究已经取得一定进展。尽管异源蛋白质的产量相对较低，但小球藻具有快速生长、易于培养以及进行翻译后修饰的能力等显著优势，因此发展前景广阔。当前如何提高生产能力仍然是小球藻异源蛋白质商业化的主要挑战，这取决于开发用于改进蛋白质表达、培养系统和下游基于生物炼制的综合生产的新型遗传工具箱方面的重大研究进展。这些领域的创新和突破将大大提高生产能力、降低生产成本，从而使小球藻成为异源蛋白质表达的竞争宿主。目前已报道的小球藻有效遗传转化方法主要有农杆菌侵染法[16]、基因枪法[17]、电击转化法[18]、聚乙二醇融合法[19]等。电击转化法是小球藻转化系统中较为常用的转化方法[20]，牟云等[21]成功通过构建电击转化体系在沙漠小球藻中表达人乳铁蛋白;Zhang等[22]以电穿孔的方式将来自大豆的转录因子基因GmDof4转化到小球藻中。普通小球藻作为可持续的、安全的生物制造商业理想分子平台，尽管目前遗传工具的开发略显落后，没有能进行商业化的生物治疗平台[23]，但在这一领域普通小球藻具有不可替代的潜力。近年来，虽然关于外源基因在小球藻中转化表达的研究不断取得进展[24]，但是仍然存在很难进行基因工程改良、外源蛋白质表达水平低且不稳定[25-26]等问题。

Lys BT1作为一种嵌合式广谱噬菌体裂解酶，在通过基因分析、筛选和预测后，剪切出具有所需能力的基因片段，并利用CRISPR定点基因编辑技术在小球藻中进行基因改造，实现裂解酶基因多拷贝整合和小球藻、枯草芽孢杆菌高效表达裂解酶代谢工程改造，实现裂解酶基因高效表达，并以小球藻构建微藻载药系统。将含有Lys BT1基因片段进行整合，构建出质粒pCAMBIA 1301-BT1，通过克隆和验证后，利用电转化法将质粒导入普通小球藻，通过荧光显微镜镜检证明噬菌体裂解酶基因在小球藻中表达成功，并通过对目标菌的杀菌活性和最小抑菌质量浓度试验验证表达的裂解酶有着良好的抑菌杀菌效果。本试验为噬菌体裂解酶的表达系统研发提供了一条新思路。不过，目前该表达系统只能瞬时表达裂解酶基因，后续仍需要进一步完善。

4结论

本试验利用普通小球藻作为表达平台，成功表达了具备良好活性的裂解酶Lys BT1。这为裂解酶大规模生产提供了一种可能，但目前仍处于待完善阶段，未来可研发稳定转化裂解酶Lys BT1的普通小球藻系统，应用于食品和医药行业。

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（责任编辑：黄克玲）

收稿日期：2023-08-31

基金项目：江苏省农业科技自主创新基金项目[CX（22）2017];江苏省政策引导类计划一带一路创新合作项目（BZ2021009）;国家重点研发计划项目（2021YFE0101800）

作者简介：束忠涛（1996-），男，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事食品安全研究；（E-mail）404339600@qq.com。王冉为共同第一作者。

通讯作者：孙利厂，（E-mail）sunlc@jaas.ac.cn