表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定

章丽娇,田宇杰,张兰香,赵冬敏,韩凯凯,黄欣梅,杨 婧,吴凤瑶,刘青涛,刘宇卓,张小飞,李 银

(1.江苏省农业科学院兽医研究所,江苏南京 210014;2.兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心,江苏泰州 225300;3.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所,贵州贵阳 550005;4.山东省日照市五莲县动物疫病预防控制中心,山东五莲 262300)

坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)是隶属于黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群的虫媒病毒,可引起肉鸭出现严重的神经症状和蛋鸭产蛋量的急剧下降[1]。自2010年首次在我国暴发并大面积传播后,坦布苏病毒病已经给我国的水禽养殖业造成了巨大的经济损失[2]。TMUV基因组为单链正股RNA,全长约10 990 bp,包含一个开放性阅读框及其两侧的5′和3′非编码区(untranslated region,UTR)。其中阅读框编码长度为3 245个氨基酸的多聚蛋白前体,在细胞和病毒蛋白酶的共同作用下裂解为3个结构蛋白(核衣壳蛋白C、前膜蛋白PrM及囊膜蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5)[3]。

以病毒基因组为载体表达外源基因在药物递送、基因治疗及疫苗研发等方面具有重要的应用价值。此外,将报告基因插入病毒基因组中构建报告病毒,可应用于高通量抗病毒药物的筛选、细胞受体的筛选以及评估疫苗或药物效果时的活体动物体内成像。目前,已经成功构建了黄热病病毒[4]、脾传脑炎病毒[5]、寨卡病毒[6-7]等多种黄病毒属成员多种类型的报告病毒。在坦布苏病毒上,国内有学者将荧光素酶基因插入到CQW1株基因组5′UTR和C蛋白基因之间[8],将增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入到 FX2010-180P株NS5蛋白基因与3′UTR之间[9],分别成功拯救出表达荧光素酶或者荧光蛋白的坦布苏报告病毒。

本研究在TMUV JXSP株感染性克隆基础上,通过反向遗传操作技术,首次将EGFP基因引入到TMUV 5′UTR和C蛋白基因间,成功构建了表达绿色荧光的坦布苏报告病毒,为后续病毒致病机制研究、疫苗研发等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、质粒和毒株 BHK-21细胞、pEGFP-N1质粒均由江苏省农业科学院兽医研究所水禽疫病防控实验室保存;pIRES2-EGFP质粒由江苏省农业科学院孙敏老师馈赠;坦布苏病毒JXSP株由中国农业大学苏敬良教授馈赠。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基,美国Thermo Fisher Scientific公司产品;胎牛血清,以色列Biological Industries公司产品;DNA分子质量标准物、高保真酶Primer Star Mix、反转录酶,日本TaKaRa Bio公司产品;病毒核酸提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒,美国Axygen公司产品;RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems(T7)、Ribo m7G Cap Analog,美国Promega公司产品;Opti-MEM®I Reduced Serum Medium、脂质体转染试剂Lipofectamine MessengerMAXTM,美国Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.1.3 主要仪器 PCR仪(TP600),日本TaKaRa Bio公司产品;小型高速冷冻离心机(5418R),德国Eppendorf公司产品;二氧化碳培养箱(BB150),美国Thermo Fisher Scientific公司产品;荧光倒置显微镜(IX-51),日本Olympus公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考坦布苏病毒JXSP株全基因组序列(登录号:JQ920423)、pEGFP-N1质粒序列和pIRES2-EGFP质粒序列设计引物(表1)。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

表1 构建坦布苏绿色荧光报告病毒的引物

1.2.2 坦布苏绿色荧光报告病毒cDNA全长的构建 按照说明书操作步骤,用Axygen病毒核酸提取试剂盒提取坦布苏病毒JXSP株RNA,TaKaRa MLT反转录酶合成病毒cDNA。以获得的cDNA为模板,通过表1中设计的引物,按图1所示方法,分段扩增,获得覆盖病毒基因组全长的PCR片段。以质粒pEGFP-N1为模板,通过EGFP-F/2A+EGFP-R引物对,扩增获得EGFP基因,同时利用引物在EGFP基因下游引入口蹄疫病毒2A蛋白(FMDV 2A)基因序列。以质粒pIRES2-EGFP为模板,通过10352F+ISRE-F/10391R+EGFP R引物对,扩增获得IRES-EGFP基因。各目的片段PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶、回收与纯化,并进行核酸浓度测定。表达EGFP的坦布苏病毒报告感染性克隆的构建策略如图1所示,拟分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因间、NS5蛋白基因和3′UTR间插入EGFP基因。利用融合PCR,连接各片段,获得插入EGFP基因的坦布苏病毒基因组全长PCR产物。融合PCR扩增体系(50 μL):Primer Star Mix(2×)25 μL,各反应片段以相同摩尔数加入,上、下游引物各1 μL,双蒸水补至50 μL。PCR反应程序:98 ℃预变性5 min;98 ℃ 10 s,52 ℃ 10 s,72℃ 5 min,共30个循环;72 ℃总延伸15 min。融合产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收纯化,一部分送至生工生物工程(上海)有限公司测序,一部分置-20 ℃保存备用。

图1 表达EGFP的坦布苏报告病毒感染性克隆构建策略

1.2.3 体外转录 根据RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems(T7)说明书操作步骤,对融合的全长PCR产物体外转录。首先,构建30 μL反应体系:5×Reaction buffer 6 μL,ATP、CTP和UTP各2.25 μL,GTP 0.5 μL,Ribo m7G Cap Analog 2.25 μL,DNA模板12 μL,Enzyme mix 3 μL。37 ℃水浴反应3.5 h,体系中加入1.8 μL DNase,37 ℃ 15 min以消除DNA模板。利用苯酚氯仿抽提法对转录产物进行纯化,并测定核酸浓度,置-70 ℃保存备用。

1.2.4 坦布苏绿色荧光报告病毒的拯救 用24孔板培养的BHK-21单层细胞,用Lipofectamine®MessengerMax试剂盒对体外转录mRNA进行转染。按说明书操作:基础DMEM培养基洗涤细胞3次,加入Opti-MEM®I Reduced Serum Medium(MEM),1 mL/孔,1.5 μL Lipofectamine®MessengerMax Reagent加至25 μL Opti-MEM并混匀,1 μg RNA加至25 μL Opti-MEM并混匀,上述两种混合液等体积混匀后室温静置5 min,加入24孔板细胞,50 μL/孔,于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱培养。培养72 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况并收集细胞培养物。

1.2.5 坦布苏绿色荧光报告病毒生长特性研究 为了确定报告病毒能否在DEF细胞上增殖,将收集的BHK-21细胞培养物接种至DEF细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白的表达情况。为了分析EGFP基因的插入对TMUV在细胞上增殖能力的影响,首先参照文献[10],用蚀斑计数法测定报告病毒和亲本毒株JXSP P4的病毒滴度,将报告病毒和原始毒株以MOI=0.1的剂量接种预先准备好的6孔板BHK-21细胞和DEF细胞,每个收样点接3个平行孔,37 ℃孵育1 h,吸弃接种液,加入含2%的FBS的DMEM培养基,37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下培养,分别于接种后12、24、36、48、60、72、96 h收集样品,蚀斑计数法测定样品病毒滴度,绘制报告病毒和亲本毒株在BHK-21细胞和DEF细胞上的生长曲线。

1.2.6 坦布苏绿色荧光报告病毒基因稳定性研究 为了研究报告病毒基因的稳定性,将收集的BHK-21细胞培养物在BHK-21细胞上连续传代,观察每一代病毒绿色荧光蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 坦布苏绿色荧光报告病毒cDNA全长的构建

PCR扩增P1a、P1b、P1c、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P6a、P6b及P6c 12个目的片段,大小依次为237、798、2 385、2 479、1 557、1 936、1 603、2 093、1 491、2 093、1 308、619 bp。电泳鉴定结果与预期相符(图2)。P1a、P1b、P1c、P2、P3、P4、P5及P6片段,P1、P2、P3、P4、P5、P6a、P6b及P6c片段通过融合PCR进行全长连接,获得分别在病毒基因组5′ UTR和C蛋白基因之间、NS5蛋白基因和3′ UTR之间插入EGFP基因的报告病毒基因组cDNA全长,标记为JXSP-5′ EGFP和JXSP-3′ EGFP,大小依次为11 931 bp和12 324 bp,电泳结果见图2。全长PCR产物经体外转录生产mRNA,苯酚氯仿抽提纯化后测定浓度分别为1 036 ng/μL和997 ng/μL,置-70 ℃保存。

A.坦布苏绿色荧光报告病毒基因组各片段PCR产物;M1.DNA标准DL 5 000;1.P1a;2.P1b;3.P1c;4.P1;5.P2;6.P3;7.P4;8.P5;9.P6;10.P6a;11.P6b;12.P6c;B.坦布苏绿色荧光报告病毒基因组全长融合PCR产物;M2、M3.DNA标准DL 15 000

2.2 坦布苏绿色荧光报告病毒的拯救与初步鉴定

将mRNA转染至BHK-21细胞拯救报告病毒,72 h后通过荧光显微镜观察进行鉴定。结果显示,JXSP-5′ EGFP转染孔细胞胞浆和胞核中均可见明显的绿色荧光,而JXSP-3′ EGFP转染孔细胞中仅可见少量微弱的绿色荧光(图3),表明成功拯救出1株能相对稳定表达EGFP的报告病毒株rJXSP-5′ EGFP。收获该转染细胞培养液,标记为rJXSP-5′ EGFP P0。

A.JXSP-5′ EGFP;B.JXSP-3′ EGFP;C.细胞对照

2.3 坦布苏绿色荧光报告病毒的生长特性

将报告病毒rJXSP-5′ EGFP P0接种DEF细胞,24 h后在荧光显微镜下观察。结果显示,感染细胞可见明显的绿色荧光(图4),表明报告病毒也能在DEF上增殖并表达荧光蛋白。蚀斑计数试验结果显示,报告病毒rJXSP-5′ EGFP P0和亲本毒株JXSP P4在BHK-21细胞上的病毒滴度分别为2.8×106PFU/mL和1.75×106PFU/mL,在DEF细胞上的滴度分别为1.05×106PFU/mL和4.5×105PFU/mL。报告病毒在BHK-21和DEF细胞上形成的蚀斑,直径略小于亲本毒株(图5)。绘制的生长曲线结果显示,从感染后12 h至96 h,报告病毒在BHK-21和DEF细胞上的平均滴度均略低于亲本毒株(图6),但在某些时间点差异不显著,表明外源基因的插入虽然一定程度降低了病毒的增殖速度,但影响不明显。

A.报告病毒rJXSP-5′EGFP;B.细胞对照

图5 亲本毒株JXSP P4和报告病毒rJXSP-5′EGFP P0在BHK-21和DEF细胞上的蚀斑形态

A.BHK-21细胞;B.DEF细胞

2.4 坦布苏绿色荧光报告病毒的遗传稳定性研究

报告病毒rJXSP-5′ EGFP P0在BHK-21细胞上连续传代过程中荧光表达情况观察结果显示,随着病毒代次的增加,表达绿色荧光的细胞量逐渐减少,直至第5代荧光信号完全消失(图7),但感染细胞仍可出现病变效应,表明报告病毒在传代过程中基因组不稳定,插入外源基因会逐渐丢失。

A～E.报告病毒rJXSP-5′ EGFP在BHK-21细胞上连续传代,P1～P5;F.细胞对照A-E.Passage 1-passage 5 of reporter virus rJXSP-5′EGFP in BHK-21 cells;F.Cell control

3 讨论

报告病毒是提高抗病毒药物筛选效率、新型疫苗研发等方面的有力工具。EGFP因其荧光强度高、毒副作用小及检测简便等优点,广泛应用于报告病毒的开发。本研究采用两种策略构建坦布苏绿色荧光报告病毒。一是在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因间引入EGFP基因。为保证病毒基因组的顺利复制和翻译,5′ UTR下游保留了C蛋白氨基端的39个氨基酸编码序列,该区域包含了5′ AUG下游序列、衣壳蛋白编码区发卡结构、5′ 保守序列等多个病毒复制和翻译必需的功能性元件[11]。同时,EGFP基因下游连接了编码具有自我剪切功能的口蹄疫病毒2A蛋白的基因序列,以便于EGFP蛋白的有效分离。该方法成功拯救了1株能高强度表达绿色荧光蛋白的报告病毒rJXSP-5′ EGFP。策略二是在病毒NS5基因和3′ UTR间引入内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site,IRES)+EGFP基因,该方法拯救的毒株能够导致BHK-21细胞出现病变效应,但细胞中荧光表达强度很低且表达量极少。分析原因,一方面可能是因为插入基因稍大,导致报告病毒基因组极不稳定,容易发生外源基因的缺失;另一方面可能是由于IRES下游蛋白的表达量本身较低[12]。针对TMUV JXSP株的两种构建策略结果表明,5′ UTR-C基因插入位点效果要好于NS5-3′ UTR位点。但有学者通过NS5-3′ UTR策略成功获得了表达绿色荧光的坦布苏报告病毒[9],这可能由毒株间的差异、具体试验方法不同等因素所导致。

遗传稳定性研究结果表明,报告病毒rJXSP-5′ EGFP基因组在传代过程中不稳定,5代后荧光信号丢失,类似现象也出现在其他黄病毒中[13]。研究报道,基于黄病毒属成员构建的报告病毒,基因组稳定性与插入的外源基因的长度有关[13]。因此,有研究人员通过插入基因组更小的NanoLuc荧光素酶获得更为稳定的报告病毒[14-15]。但若以黄病毒为载体进行疫苗研发,就必须克服这一困难,使病毒基因组能够稳定的容纳更大的外源基因。 Evgeniya K等[6]研究人员通过对5′ UTR下游保留的C蛋白基因进行移码处理后插入外源基因的方式构建了能稳定表达绿色荧光蛋白的寨卡病毒。

综上所述,本研究首次对比了TMUV 5′ UTR-C和NS5-3′ UTR两个位点用于引入外源基因的效果,并成功获得了1株能相对稳定表达绿色荧光蛋白的报告病毒rJXSP-5′ EGFP株。后续研究将进一步优化构建的方法,以期获得更加稳定的报告病毒,为新型疫苗的研制提供强有力的技术支撑。