微小RNA-138/NGAL对缺血再灌注诱导人肾小管上皮细胞的影响

邱冬豪

[摘要] 目的 探究微小RNA-138（microRNA-138，miR-138）调控中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）对缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）诱导人肾小管上皮（HK-2）细胞损伤的影响。方法 HK-2细胞构建I/R模型，分別转染miR-138 模拟物、miR-138 抑制剂、NGAL、NGAL + miR-138 模拟质粒，qRT-PCR测定不同细胞miR-138或NGAL mRNA表达鉴定转染结果，细胞活力检测（cell counting kit-8，CCK-8）法和流式细胞术测定细胞活性和凋亡。ELISA、Western blot法分别测定miR-138模拟物、miR-138抑制剂对I/R细胞白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，以及Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、NF-κB抑制蛋白（inhibitor-NF-κB，IκBα）、磷酸IκBα（p-IκBα）、NGAL蛋白表达的影响。结果 I/R细胞miR-138 mRNA表达、细胞活力降低，凋亡增加（P<0.01）。质粒转染成功，miR-138模拟物促进IR细胞活力，降低凋亡和NGAL mRNA表达（P<0.01）；miR-138 抑制剂、NGAL 模拟降低IR细胞活力，增加凋亡和NGAL mRNA表达（P<0.01）；NGAL 模拟对IR细胞的损伤作用可被miR-138 模拟逆转。miR-138 抑制剂可增加I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡，上调TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达，下调IκBα蛋白表达（P<0.05）；miR-138模拟物可降低I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡，下调TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达，上调IκBα蛋白表达（P<0.05）。结论 miR-138通过调节NGAL和TLR4/NF-κB途径降低细胞凋亡和炎症因子水平，对I/R诱导的HK-2细胞发挥保护作用。

[关键词] 人肾小管上皮细胞；缺血/再灌注；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；TLR4/NF-κB通路

[中图分类号] R692.6      [文献标识码] A    [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.11.012

Effect of microRNA-138 on the ischemia/reperfusion of human renal tubular epithelial cells

QIU Donghao

Department of Nephrology， Affiliated Hangzhou First Peoples Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310008， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To explore the effect of microRNA-138 （miR-138） on injury of ischemia/reperfusion （I/R） induced human renal tubular epithelium （HK-2） cells through neutrophil gelatinase-associated lipocalin （NGAL）. Methods HK-2 cells were used to construct I/R model cells， and transfected with miR-138 mimic， miR-138 inhibitor， NGAL， NGAL + miR-138 mimic plasmids， respectively. qRT-PCR determined the expression of miR-138 or NGAL mRNA in different cells to identify the transfection results. Cell counting kit-8 （CCK-8） method and flow cytometry were used to detected the activities and apoptosis of cells. ELISA and western blot were used to determine the effects of miR-138 mimic or miR-138 inhibitor on levels of interleukin （IL）-6， IL-1β， tumor necrosis factor （TNF-α） and protein expression of toll like receptor 4 （TLR4）， nuclear factor kappa-B （NF-κB）， inhibitor of NF- κB （IκBα）， pho-IκBα （p-IκBα）， NGAL of cells. Results miR-138 mRNA expression and cell activity were decreased， while apoptosis increased in I/R cells （P<0.01）. Plasmid transfected well， miR-138 mimic increased activity while decreased apoptosis and NGAL mRNA expression of I/R cell. miR-138 inhibitor or NGAL mimic inhibited activity and increased apoptosis and NGAL mRNA expression of I/R cell. The negative effects of NGAL mimic on I/R cell were reversed by miR-138 mimic. miR-138 inhibitor increased levels of IL-6， IL-1β， TNF-α of I/R cell， and increased TLR4， NF-κB， p-IκBα， NGAL protein expression and decreased IκBα protein expression （P<0.05）. While miR-138 mimic decreased levels of IL-6， IL-1β， TNF-α of I/R cell， and decreased TLR4， NF-κB， p-IκBα， NGAL protein expression and increased IκBα protein expression （P<0.05）. Conclusion miR-138 reduced apoptosis and inflammation factor levels to play a protective role on I/R induced HK-2 cells may through regulating NGAL and TLR4/NF- κB pathway.

[Key words] Human renal tubular epithelial cells; Ischemia/reperfusion; Neutrophil gelatinase related lipid transporter; TLR4/NF-κ B pathway

腎脏缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）在临床中常见，多出现于肾脏移植、心脏外科手术等过程中，是造成急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）最常见的原因之一[1-2]。肾I/R损伤发生的病理机制复杂，涉及内质网应激、活性氧聚集、凋亡、炎症等一系列病理生理过程，导致肾小管上皮细胞凋亡引起肾功能损伤[3]。

微小RNA（microRNA，miR）是生物体内高度保守的非编码小分子RNA，可作为肾脏I/R损伤诊断与鉴别诊断的生物标志物[2]。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）广泛存在于各种细胞类型中，可用于临床早期肾损害风险预测[4-6]。NGAL在糖尿病肾病组织中显著高表达，与Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路共同参与促进肾组织炎症和纤维化[7-9]。miR138可抑制NGAL发挥抗肿瘤作用，但其两者在肾I/R损伤中作用还未明确。因此，本研究初步探究miR-138/NGAL在肾脏I/R损伤中的表达及可能作用。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  细胞和试剂  HK-2细胞（赛百慷生物技术公司，iCell-h096）；HK-2专用培养基（赛百慷生物技术公司，iCell-h096-001b）；CCK8检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；小鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β试剂盒（睿信生物科技公司）；TLR4、NF-κB、NF-κB抑制蛋白（IκBα）、磷酸IκBα（p-IκBα）、NGAL抗体（美国Affinity抗体公司）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（美国Proteintech公司）；流式凋亡试剂盒（美国BD公司）。

1.1.2  仪器  BB150细胞培养箱、Micro17R低温高速离心机、Nanodrop one mRNA定量仪（美国赛默飞公司）；AE2000光学显微镜（德国Motic公司）；CMaxPlus酶标仪（美国MD公司）；Ts2-FC倒置显微镜（日本尼康公司）；Mastercycler普通PCR仪（德国Eppendorf公司），实时荧光定量PCR仪（美国罗氏公司），NovoCyte流式细胞仪（美国安捷伦公司），610020-9Q化学发光仪（中国勤翔公司）。

1.2  方法

1.2.1  体外I/R模型制备方法  HK-2细胞于5% CO2、37℃的培养箱中常规培养。取对数生长期细胞继续培养，至细胞融合生长至80%，平衡盐溶液替换培养基。80?mol/L抗霉素A和10mmol/L 2-脱氧-d-葡萄糖共孵育1h，以诱导HK-2细胞缺血性损伤。完全生长培养基中培养诱导后细胞实现I/R模型细胞。

1.2.2  细胞转染  采用脂质体3000试剂转染miR-138 模拟/抑制剂质粒、NGAL过表达质粒（上海吉玛制药技术有限公司构建合成）。取I/R模型细胞，按照说明书将miR-138 模拟物及对照（NC）、miR-138 抑制剂质粒及对照、NGAL、NGAL + miR-138 模拟质粒转染I/R细胞。根据转染的质粒，将细胞分为组1：对照组、I/R组、I/R + miR-138 模拟组、I/R + miR-138 抑制剂组；组2：I/R组、I/R + miR-138 模拟物组、NGAL + I/R组、NGAL + I/R + miR-138 模拟物组。

1.2.3  qPCR测定miR-138、NGAL mRNA表达  Trizol试剂提取2组细胞的RNA。反转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），PCR进行DNA扩增。

引物序列：人NGAL上游：5-CCACCTCAGACCT GATCCCA-3，下游：5-CCCCTGGAATTGGTTGT CCTG-3；人miR-138上游：5-TCCGAGCCTGACTA AGTGTTGTGGTCGA-3，下游：5-GTGCAGGGTCC GAGGT-3；人U6上游：5-CTCGCTTCGGCAGCAC ATA-3，下游：5-GTCGAGGGTCCGAGCT-3；人GAPDH上游：5-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC- 3，下游：5-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3。U6、GAPDH分别作为miR-138、NGAL内参，2-△△CT法对结果进行相对定量分析。

1.3  检测方法

制备两组细胞的细胞悬液，接种至96孔板培养。加入10μl CCK-8试剂，孵育2h。酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞细胞活性。

将两组细胞接种于6孔板。预冷PBS清洗，调整细胞浓度至1×106个/ml。加入500μl结合缓冲液，离心弃上清，再加入100μl结合缓冲液混匀后，分别加入5μl Annexin V-FITC与10μl 碘化丙啶（propidium iodide，PI），充分混匀；室温避光反应15min。最后加入结合缓冲液400μl，1h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。

收集组1细胞，离心，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书，测定IL-6、IL-1β、TNF-α含量。收集组1细胞，清洗，离心，裂解液处理细胞，制备蛋白样本。BCA法测定总蛋白含量。电泳，转膜。5 %脱脂奶粉孵育，清洗3遍。稀释后的TLR4、NF-κB、IκBα、p-IκBα、NGAL、GAPDH抗体孵育过夜。TBST清洗，孵育对应二抗。显影蛋白条带，GAPDH做内参，计算各蛋白的相对表达量。

1.4  统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理分析。计量资料以均值±标准差（）表示，采用One-way-ANOVA单因素方差分析，进一步组间两两比较采用Tukey检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  miR-138转染对I/R细胞活力的影响

与对照组比较，I/R组细胞miR-138 mRNA表达量以及细胞活力显著降低（P<0.01）。与I/R组相比，I/R+miR-138 模拟物细胞mRNA表达量、细胞活力显著升高（P<0.01），I/R+miR-138 抑制剂细胞miR-138 mRNA表达量、细胞活力则显著降低（P<0.01），而I/R+miR-138 模拟物-NC与I/R+miR-138抑制剂-NC细胞miR-138 mRNA表达量、活力差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

2.2  miR-138、NGAL轉染对I/R细胞活力的影响

与I/R组相比，I/R + miR-138 模拟物细胞NGAL mRNA表达量降低、细胞活力升高（P<0.01）， NGAL + I/R细胞NGAL mRNA表达量升高、细胞活力降低（P<0.01）。与NGAL+I/R细胞相比，NGAL + I/R + miR-138模拟细胞NGAL mRNA表达下降、活力升高（P<0.01），见图2。

2.3  miR-138、NGAL转染对I/R细胞凋亡的影响

与对照组比较，I/R组细胞凋亡增加（P<0.01）。与I/R组比较，I/R + miR-138 模拟组细胞凋亡降低（P<0.01），I/R + miR-138 抑制剂组细胞凋亡增加（P<0.01）。与I/R组比较，NGAL + I/R细胞凋亡增加（P<0.01）；与NGAL + I/R细胞相比，NGAL + I/R + miR-138 模拟细胞凋亡下降（P<0.01），见图3。

2.4  miR-138对I/R细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平的影响

与对照组比较，I/R组细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01）；与I/R组比较，I/R+miR-138模拟组细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P<0.01），而I/R + miR-138 抑制剂组细胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01），见图4。

2.5  miR-138对I/R细胞蛋白表达的影响

与对照组比较，I/R组细胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达增加，IκBα蛋白表达降低（P<0.01）。与I/R细胞比较，I/R + miR-138 模拟物细胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达降低（P<0.05），IκBα蛋白表达增加（P<0.01）；I/R + miR-138 抑制剂细胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表达增加（P<0.05），IκBα蛋白表达降低（P<0.01），见图5。

3  讨论

肾组织近曲小管对缺血最为敏感[10]。肾缺血后，内皮细胞和平滑肌细胞迅速受损；而当血流恢复/再灌注时，血流增加，白细胞激活、聚积后通过炎症反应和细胞毒性反应可增加肾组织细胞损伤[11-13]。而miRs可通过抑制细胞自噬、凋亡，减轻肾组织损伤，发挥I/R后肾保护作用[14-15]。本研究中，所构建的I/R细胞活力下降、凋亡增加、miR-138表达降低；miR-138抑制剂转染加重了上述细胞的I/R表现；而miR-138模拟转染可促进I/R细胞活力、减少凋亡，提示miR-138表达对I/R细胞具有保护作用。NGAL是脂质运载蛋白超家族的成员之一，肾小管上皮细胞缺血后出现细胞内水肿及细胞核凋亡，释放NGAL成为其主要来源[16]。在I/R诱导的急性肾损伤小鼠肾组织内，NGAL蛋白表达增加[17]。本研究中I/R细胞NGAL mRNA及蛋白表达显著升高，NGAL 模拟转染增加了I/R细胞的凋亡，而miR-138 模拟可逆转NGAL 模拟对I/R细胞的促凋亡作用，推测miR-138可能靶向负调控NGAL，抑制肾I/R细胞的凋亡。

TLR4/NF-κB参与肾脏I/R炎症反应过程，NF-κB作为关键分子可诱导炎性TNF-α、IL-6、IL-1表达，改变肾小球基底膜通透性，加重组织纤维化和炎症反应[18-19]。κB激酶抑制剂IκBα可通过与NF-κB结合，阻止NF-κB发挥转录功能，缓解组织炎症损伤[20-21]。本研究中I/R细胞TLR4/NF-κB通路、p-IκBα表达增加，IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高；miR-138抑制剂加重了I/R细胞上述表现；而miR-138模拟物能够促进I/R细胞IκBα表达，抑制TLR4/NF-κB通路表达，降低IL-6、IL-1β、TNF-α水平，因此推测miR-138可能抑制TLR4/NF-κB信号减轻I/R细胞的炎症损伤。

综上所述，miR-138可减少I/R诱导的人肾小管上皮细胞炎症、凋亡，其作用可能通过调控NGAL、TLR4/NF-κB通路实现。miR-138与NGAL两者联合对肾I/R的诊断预后及治疗作用还需临床进一步明确。

利益冲突：作者声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] 任燕， 崔建民， 沈文. 肾脏缺血再灌注损伤的功能MRI实验研究进展[J]. 国际医学放射学杂志， 2019， 42（6）： 688–691.

[2] 潘旭鳴， 陈丹垒， 马红珍. miRNA在肾脏缺血再灌注损伤中的作用研究进展[J]. 浙江医学， 2019， 41（10）： 1091–1095.

[3] 徐鸿， 梁国标. 内质网应激-凋亡途径在肾缺血再灌注损伤中的研究进展[J]. 遵义医科大学学报， 2022， 45（1）： 118–126.

[4] 杜飞璇， 曲辅政. 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在心血管疾病及相关肾损害中的研究进展[J]. 中国当代医药， 2023， 30（6）： 39–43.

[5] 车春红， 朱国贞. NGAL与肾脏疾病相关性的研究进展[J]. 生命科学， 2019， 31（1）： 99–105.

[6] 姜亚倩， 毛冰昆， 付安冉， 等. 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在妇产科领域中的研究进展[J]. 中国现代医生， 2022， 60（5）： 189–191.

[7] ASHRAFI JIGHEH Z， GHORBANI HAGHJO A， ARGANI H， et al. Empagliflozin attenuates renal and urinary markers of tubular epithelial cell injury in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Indian J Clin Biochem， 2020， 35（1）： 109–114.

[8] WU C， CHEN F. The function of miR-199a-5p/Klotho regulating TLR4/NF-κB p65/NGAL pathways in rat mesangial cells cultured with high glucose and the mechanism[J]. Mol Cell Endocrinol， 2015， 417： 84–93.

[9] LEE Y C， TZENG W F， CHIOU T J， et al. MicroRNA-138 suppresses neutrophil gelatinase-associated lipocalin expression and inhibits tumorigenicity[J]. PloS One， 2012， 7（12）： e52979.

[10] ZHANG Y， NAKANO D， GUAN Y， et al. A sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor attenuates renal capillary injury and fibrosis by a vascular endothelial growth factor-dependent pathway after renal injury in mice[J]. Kidney Int， 2018， 94（3）： 524–535.

[11] LEGRAND M， MIK E G， JOHANNES T， et al. Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney[J]. Mol Med， 2008， 14（7-8）： 502–516.

[12] ZHAO H， ALAM A， SOO A P， et al. Ischemia- reperfusion injury reduces long term renal graft survival： Mechanism and beyond[J]. EBioMedicine， 2018， 28： 31–42.

[13] 李昕， 王芷寧， 付璐， 等. 缺血-再灌注氧化损伤机制及其对不同器官功能的影响[J]. 中国比较医学杂志， 2022， 32（7）： 149–154.

[14] 李莎莎， 刘晓茜， 黄静， 等. miR-145-5p对肾缺血/再灌注损伤大鼠的肾脏保护作用及其机制[J]. 山东医药， 2022， 62（35）： 29–33.

[15] SONG T， CHEN M， RAO Z， et al. miR-17-92 ameliorates renal ischemia reperfusion injury[J]. Kaohsiung J Med Sci， 2018， 34（5）： 263–273.

[16] 何虹， 王睿， 水华. NGAL在窒息新生儿急性肾损伤中的研究进展[J]. 武汉大学学报（医学版）， 2023， 44（3）： 376–379.

[17] 余婷， 张妮， 陈思羽， 等. 猫爪草对缺血再灌注小鼠急性肾损伤的作用及机制[J]. 贵州医科大学学报， 2021， 46（11）： 1301–1308.

[18] 殷春晓， 马亚琼， 刘萍， 等. 黄芪甲苷通过TLR4/NF-κB信号通路对肾脏缺血再灌注大鼠的影响[J]. 社区医学杂志， 2022， 20（8）： 430–434.

[19] ZHOU Y， MA X Y， HAN J Y， et al. Metformin regulates inflammation and fibrosis in diabetic kidney disease through TNC/TLR4/NF-κB/miR-155-5p inflammatory loop[J]. World J Diabetes， 2021， 12（1）： 19–46.

[20] 张华阳， 张俊勇， 郑白术， 等. 肾缺血-再灌注肺损伤发病机制及治疗[J]. 临床与病理杂志， 2022， 42（9）： 2284–2291.

[21] 侯道荣， 刘振， 崔斯童， 等. 丹参酮II-A通过调控TLR4/IκBα/NFκB信号通路抑制LPS诱导的细胞炎症[J]. 中国药理学通报， 2021， 37（2）： 210–214.

（收稿日期：2023–08–02）

（修回日期：2024–02–19）