裙带菜孢子叶组分及其生物活性研究*

张 洋

(芜湖职业技术学院，安徽 芜湖 241003)

裙带菜(Undaria pinnatifida)为褐藻属一年生海藻。主要生长在我国东部沿海及日本、韩国沿海低潮线附近至10 m左右的海床上，形状呈椭圆形，高50～150 cm。从冬季到春季生长旺盛，从春季到初夏，在根部附近产生耳形孢子囊。裙带菜中含有大量矿物质，如钾、钠和维生素等[1]。孢子叶(图1)位于裙带菜茎部靠近假根的部分附件的上方[2]，是裙带菜生殖细胞聚集和营养集中的区域。裙带菜孢子叶含有丰富的营养物质，如褐藻糖胶、海藻酸、钙、碘、膳食纤维和褐藻黄质，具有增强免疫力、预防高血压、保护头发、预防动脉硬化以及缓解便秘的作用[3-5]。此外，孢子叶中具有多种生物活性成分，对其研究开发逐渐聚焦于保健食品和化妆品领域[6-7]。本文对裙带菜孢子叶的活性成分进行提取，并对其生物活性进行探究，以期为裙带菜孢子叶的有效开发利用提供实验依据。

图1 裙带菜孢子叶Fig.1 Sporophyll of undaria pinnatifida

1 实 验

1.1 种藻来源

裙带菜于2022年4月采自宁波象山港附近海域。所采集的裙带菜就地海水洗涤处理，去除藻体表面泥沙。

1.2 主要仪器与设备

HZ-C恒温振荡器，太仓市实验设备厂；XO-3200DT超声波清洗机，南京先欧仪器制造有限公司；BS 124S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；旋转蒸发器RE-85Z，上海青浦沪西仪器厂；UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司；7780Ⅱ高速大容量冷却离心机，日本久保田公司。

1.3 孢子叶成分提取

1.3.1 色素提取

取去杂新鲜裙带菜孢子叶冻干，用粉碎机粉碎；将100 g原料粉末装入蒸馏瓶中，加入300 mL乙醇溶液溶解；室温下用磁力搅拌器搅拌48 h后进行减压过滤，该操作重复两次，所得滤液用旋转蒸发仪去除溶剂，得到干燥黄色沉淀物为海藻色素(图2)。

图2 裙带菜孢子叶活性成分提取工艺流程Fig.2 Extraction process of active ingredients from sporophyll of undaria pinnatifida

1.3.2 多糖提取

往色素提取后的沉淀物中加600 mL稀盐酸(0.5 M)，室温下搅拌24 h，减压过滤；中和滤液浓缩至50 mL；室温下蒸馏水透析后，进行冻干，得到硫酸多糖。

1.3.3 海藻盐类提取

通过碱处理提取海藻酸钠。往硫酸多糖提取后的滤渣中加600 mL 1% Na2CO3溶液，80 ℃搅拌7 h，减压过滤，中和滤液浓缩至50 mL，冻干后得海藻酸钠。

1.4 孢子叶成分分析

1.4.1 样品制备

将0.5 g孢子叶粉末放入三角烧瓶中，加水定容至250 mL，100 ℃加热5 h，所得样品浓度为2.0 mg/mL。

1.4.2 糖含量测定

多糖含量的测定采用硫酸苯酚改良法[8]。将0.5 mL样品与0.5 mL 5%苯酚溶液混合，加入2.5 mL浓硫酸，搅拌均匀，室温下冷却30 min，用紫外可见分光光度计在490 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，得：

y=0.007 3x+0.030 8，R2=0.986 6

(1)

式中：y为490 nm下的吸光度值；x为标准物葡萄糖的质量浓度，μg/mL。

1.4.3 酚含量测定

酚含量的测定采用福林酚改良法[9]。将0.5 mL样品与0.5 mL福林酚试剂混合，静置3 min，加入2.5 mL 0.4 M碳酸钠溶液，搅拌均匀，50 ℃水浴5 min，室温冷却30 min，用紫外可见分光光度计在765 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，得：

y=0.013 8x+0.023 4，R2=0.998 2

(2)

式中：y为765 nm下的吸光度值；x为标准物没食子酸的质量浓度，μg/mL。

1.4.4 蛋白质含量测定

蛋白质定量采用二喹啉甲酸法(BCA)[10]。将0.1 mL样品与2.0 mL BCA工作液(WR，BCA试剂A和BCA试剂B按50∶1的比例混合)，37 ℃温浴30 min，室温冷却10 min，用紫外可见分光光度计在562 nm波长下测定吸光度。以BSA为标准物测定样品中蛋白质含量。

1.5 光合色素分析

采用薄层色谱法(TCL)分离色素[11]。

1.6 红外分析

孢子叶提取的多糖样品、海藻盐样品分别用溴化钾压片，在400～4 000 cm-1处进行红外测定。

1.7 多糖生物活性测定

1.7.1 DPPH自由基清除活性实验

准备6根试管，分别加入1.0 mL 0.4 mM DPPH-C2H5OH溶液和1 mL MES缓冲液(200 mM/L，pH 6.0)。依次加入1.5 mL、1.6 mL、1.7 mL、1.8 mL、1.9 mL、2.0 mL 50%乙醇，再分别加入0.5 mL、0.4 mL、0.3 mL、0.2 mL、0.1 mL样品，使总体积均达到 0.4 mL，静置20 min，用紫外可见分光光度计在520 nm波长下测定吸光度。绘制标准曲线，得

y=3.165 2x+0.014 7，R2=0.973 1

(3)

式中：y为Trolox量，μmol；x为标准物Trolox的吸光度。

1.7.2 抑制透明质酸酶活性实验

参考Maeda[12]和Kakegawa等[13]的方法。透明质酸酶溶液50 μL添加至100 μL样品中，37 ℃、20 min恒温振荡反应。添加活性化溶剂Compound 48/80溶液100 μL，37 ℃、20 min恒温振荡反应。添加透明质酸钠溶液250 μL，37 ℃、40 min恒温振荡反应。添加0.4 N氢氧化钠溶液100 μL后反应中止，添加硼酸溶液100 μL，3 min水浴沸煮。冷却至室温后，添加p-DABA溶液3 mL，37 ℃、20 min恒温振荡反应。用紫外可见分光光度计在585 nm波长下测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 孢子叶成分提取

从100 g孢子叶中提取色素7.0 g，提取褐藻糖胶3.6 g，海藻酸盐5.9 g。得率为：

Y=(m/W)×100%

(4)

式中：m为提取物质量；W为原料质量。

表1 裙带菜孢子叶成分提取得率Table 1 Extraction yields of bioactive substances from undaria pinnatifida sporophyll

2.2 成分分析

根据式(1)葡萄糖标准曲线计算出糖含量为13.5%；根据式(2)没食子酸标准曲线计算出多酚含量为19.32 mg GAE/g；蛋白质含量为9.92%。

2.3 光合色素分析

从裙带菜叶和孢子叶中提取色素的薄层色谱显色结果如图3所示。在孢子叶中观察到六个斑点：Rf=0.07为岩藻黄素，Rf=0.26为叶绿素b，Rf=0.31为叶绿素a，Rf=0.40为叶黄素b，Rf=0.49为叶黄素a，以及上方淡红色斑点名称不详的色素。而裙带菜叶中6处斑点与孢子叶相同。

图3 色素薄层色谱分析Fig.3 Pigment TLC

值得注意的是，本实验检测到的岩藻黄素是一种类胡萝卜素，存在于裙带菜等褐藻中，是褐藻光合作用所需的一种色素。在光合作用中，叶绿素负责吸收光。在有氧气发生的光合反应中，反应中心色素仅限于叶绿素a。但仅靠叶绿素无法进行光合作用，光合作用是由中心色素和天线色素共同完成，即由类胡萝卜素和叶绿素蛋白结合，将更多光能高效地传递给叶绿素a。天线色素本身不直接参与光化学反应，仅负责收集光能并将其传递给中心色素，不同种类的海藻，其天线色素的组成也各不相同。在充当天线色素的类胡萝卜素中，已知褐藻和硅藻中含有岩藻黄素。本实验检测到的名称不详的红色色素，也可能是天线色素的一种。

2.4 多糖红外分析

2.4.1 酸提取多糖

图4显示了从孢子叶中提取多糖的红外光谱。3 447 cm-1吸收峰为O-H伸缩振动峰，2 924 cm-1吸收峰为C-H伸缩振动峰，1 636 cm-1处的强吸收带为羰基的不对称伸缩振动，1 260 cm-1吸收峰为O=S=O伸缩振动峰，820 cm-1处出现了S-O的伸缩振动峰，表明了硫酸基的存在。图5为褐藻糖胶的红外吸收光谱，与图4所示吸收峰位置相同，表明酸提取法从孢子叶中提取的多糖为褐藻糖胶。

图4 裙带菜孢子叶提取多糖红外吸收光谱Fig.4 Infrared absorption spectrum of polysaccharides from sporophyll of undaria pinnatifida

图5 褐藻糖胶红外吸收光谱Fig.5 Infrared absorption spectrum of fucoidan

2.4.2 碱提取海藻盐

图6显示了从孢子叶中提取海藻盐的红外光谱。3 445 cm-1吸收峰为O-H伸缩振动峰，2 924 cm-1吸收峰为C-H伸缩振动峰，1 623 cm-1、1 404 cm-1为COO-伸缩振动峰，1 094 cm-1为甘露糖醛酸(M)的吸收峰，1 032 cm-1为葡萄糖醛酸(G)的吸收峰，具有M和G吸收的特征。图7为试剂海藻酸钠的红外吸收光谱，与图6所示吸收峰位置相同，表明从孢子叶中提取的海藻盐为海藻酸钠。

图6 裙带菜孢子叶提取海藻酸盐红外吸收光谱Fig.6 Infrared absorption spectrum of alginic acid salt from sporophyll of undaria pinnatifida

图7 海藻酸钠红外吸收光谱Fig.7 Infrared absorption spectrum of sodium alginate

2.5 多糖生物活性

2.5.1 DPPH自由基清除活性

确定1 g样品中自由基清除活性成分的Trolox当量：

(5)

式中：A——DPPH溶液的吸光度(样品吸光度-空白吸光度)

f——标准溶液系数≈1.00

V——样品溶液体积，mL

D——样品溶液的稀释倍数

S——萃取所用溶剂体积，mL

W——样品采集量，g

根据式(5)，计算出DPPH自由基清除活性为407.9 μmol TE/g。

2.5.2 透明质酸酶抑制活性

测得的吸光度数值根据下列公式计算对酶活性的抑制

(6)

式中：S为样品吸光度值，SB为空白试样吸光度值，C为对照组吸光度值，CB为空白对照组吸光度值标准物质0.7 mg/mL浓度的cromolyn溶液对透明质酸酶抑制活性为71.3%，2.0 mg/mL样品溶液对透明质酸酶抑制活性为82.0%，与标准物抑制活性相当。

3 结果与讨论

从裙带菜孢子叶中提取的色素、褐藻糖胶和海藻酸钠的含量分别为7.0%、3.6%和5.9%。孢子叶中糖含量为13.5%，多酚含量为19.32 mg GAE/g，蛋白质含量为9.92%。色素薄层色谱分析显示出六个斑点，从下到上依次为：岩藻黄素、叶绿素b、叶绿素a、叶黄素b、叶黄素a以及可能是天线色素的一种红色色素。红外分析从裙带菜孢子叶中提取的褐藻糖胶在 1 260 cm-1处显示O=S=O伸缩振动峰，表明了硫酸基团的存在；孢子叶中提取的海藻酸钠在1 094 cm-1、1 032 cm-1处有吸收峰，具有甘露糖醛酸和葡萄糖醛酸的吸收特征。DPPH自由基清除活性测定显示，Trolox当量407.9 μmol TE/g，抗氧化活性非常高；对透明质酸酶抑制活性的测量显示，抑制活性高达82%。此研究为裙带菜孢子叶中提取的褐藻糖胶、海藻酸钠作为保健食品、药品和化妆品的开发利用提供依据。