生理性拉应力通过Nell-1/Ihh 信号通路对ATDC5 软骨细胞分化的调控作用

董紫薇, 齐慧川, 马 俊, 薛 晴, 聂瑾涵, 于 航, 胡 敏

（1. 吉林大学口腔医院正畸科，吉林 长春 130021；2. 吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春 130021）

Nel 样1 型分子（Nel-like molecule type 1，Nell-1）是一种在骨-软骨组织中广泛分布的分泌蛋白，其对骨-软骨组织缺损修复的促进作用逐渐被揭示［4］。Nell-1 可通过Ihh 信号通路调控软骨内稳态和软骨内成骨［5］，但在机械应力介导的软骨内成骨过程中Nell-1 能否对机械力产生应答并通过Ihh信号调控软骨细胞分化的作用尚不明确。本研究旨在观察Nell-1 对生理性拉应力刺激的反馈，分析软骨细胞中机械力信号的生物转化效应及相关机制，为骨性Ⅱ类错下颌发育不足的治疗提供理论依据和诊疗思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要材料和仪器小鼠软骨ATDC5 细胞系购自上海憬宏生物科技有限公司。DMEM/F-12 培养基购自美国Hyclone 公司，抗Nell-1 抗体购自美国GENETex 公司，抗Ihh 抗体和环巴胺购自英国Abcam 公司，抗Runt 相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2， Runx2） 抗体购自美国CST 公司， GAPDH 一抗购自武汉Proteintech 公司，兔源和鼠源二抗均购自上海碧云天生物技术有限公司，RNA 逆转录试剂盒和SYBR 荧光染料购自翌圣生物科技（上海）有限公司。Forcel 四点弯曲细胞力学加载仪由四川大学华西口腔医学院和成都科技大学联合研制，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪购自美国Bio-Rad 公司。

被告:The first，that Opupa,send the phone number to Nigeria to prosecute.(首先，那个Opupa,把电话号码送回尼日利亚去起诉。)

1.2 细胞培养和拉应力加载将ATDC5 细胞置于含体积分数10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM/F12 培养基中，在37 ℃和体积分数5% CO2培养箱中培养，每2 d 换液1 次，1∶3 传代。应用四点弯曲细胞力学加载仪进行细胞加力，以1×105mL-1的密度将ATDC5细胞接种于79.00 mm×40.00 mm×1.38 mm 的四点弯曲细胞应变片上，置于直径为100 mm 的培养皿中，待细胞贴壁后将加力板置于细胞皿内加力。

1.3 细胞分组和处理为观察生理性拉应力对软骨细胞增殖和分化的影响，先对细胞施加频率为0 Hz 和力值为2 000 μstrain （相当于1.5 mm 位移［6］）的拉应力，加力时间为2 h。同时设未加力的细胞作为对照组，其余条件相同。

为验证Nell-1 和Ihh 信号相关基因对拉应力的反馈，对细胞分别施加力值为2 000 μstrain 不同加力时间（1、2和4 h）的拉应力和不同力值（1 000、2 000 和3 000 μstrain） 加力时间为2 h 的拉应力，同时设未加力的细胞为对照组。

为了分析软骨细胞中机械力信号的生物转化机制，待ATDC5 细胞贴壁生长后施以血清饥饿法过夜培养，次日更换完全培养液培养3 d，分为对照组（不进行任何处理）、环巴胺组（10 μmol·L-1环巴胺）、拉应力组（施加2 000 μstrain 拉应力2 h） 和环巴胺+拉应力组（10 μmol·L-1环巴胺处理同时施加2 000 μstrain 拉应力2 h）。

2.1 2 组细胞中增殖和分化相关基因mRNA 表达水平ATDC5 细胞在加载2 000 μstrain/2 h 拉应力后状态良好， 无脱膜现象。 与对照组比较，2 000 μstrain/2 h组细胞中Col-Ⅱ、Col-Ⅹ、Aggrecan、SOX9、VEGF 和PCNA mRNA 表达水平均明显升高（P＜0.01），表明生理性拉应力可以促进软骨的增殖和分化。见图1。