超声在骨组织工程中的应用进展

王洋 肖龙飞 耿弼江 沈龙祥

骨移植是目前临床治疗创伤、感染和肿瘤所导致严重骨缺损的主要手段[1]。自体骨移植因其良好的生物活性和无免疫原性而被认定为骨移植的“金标准”[2]。然而，供体来源有限和术后感染等严重并发症限制了其在临床上的广泛应用[3]。为了解决上述问题，骨组织工程技术应运而生。

骨组织工程是结合生命科学、生物工程和材料科学所形成的新兴交叉学科，旨在为骨缺损修复提供新的解决方案[4]。正如沃尔夫定律和机械恒温器假说所言[5]，机械刺激可用于促进骨骼形成。成骨细胞和骨细胞都属于刺激敏感细胞，单纯将骨组织工程支架（BTES）填充到骨缺损处无法为周围骨组织提供相应的机械刺激，这可能导致细胞物质代谢减慢，不利于骨愈合[6]。近年来，除了将各种细胞和生物活性分子与BTES 相结合外，超声波、光/热和电/磁场等多种外源性物理刺激也被应用到组织工程技术中，国内外诸多研究表明它们对骨组织再生具有一定的促进作用[7]。

超声波是一种频率大于20 kHz 的机械振动波，其在介质中传播时可以引起粒子间的局部振动，对细胞产生机械效应。这种效应可以增强细胞物质代谢、调节细胞功能，引起细胞内生化反应，从而促进组织修复和再生[8]。此外，超声波对生物组织有较强的穿透能力且安全性较高，可以对组织深处的细胞和材料进行无创性干预[9]。低强度脉冲超声（LIPUS）是一种声强小于3 W/cm2、以脉冲形式输出的超声波[10]，其可以提供低强度的机械刺激，对细胞产生微机械作用[11]。早在1994 年和2000 年，LIPUS 就被美国食品药品监督管理局批准用于治疗新发骨折和骨不连[12-14]。

1 促进细胞增殖与迁移

LIPUS 已被证实可以提高BTES 中骨髓间充质干细胞（BMSC）和其他细胞的活力并促进细胞增殖[15]。Carina 等[16]将双链DNA 的含量作为镁-羟基磷灰石/胶原复合支架上BMSC 增殖的衡量标准，观察到经LIPUS 处理14 d 后，双链DNA的含量增加了1.7 倍。Yang 等[17]利用LIPUS 刺激大鼠BMSC，发现其存活率提高了19.57%，且对LIPUS 的参数进一步调整后（6.92 V，1.02 MHz，7.3 min），BMSC 的存活率进一步提高了5.36%。Xie 等[18]研究发现，LIPUS 刺激可以驱动BMSC从G0/G1 期转变到S 期和G2/M 期，这可能是通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路和上调细胞周期蛋白D1 来实现的。Fan 等[19]使用CCK-8 法评估种植在钛合金支架上BMSC 的活力和增殖情况，发现在LIPUS 刺激的第4 天和第7 天，细胞活力明显增强且数量显著增加。Cai 等[20]在钛合金表面制备了钛酸钡压电陶瓷涂层，并应用LIPUS 对附着其上的MC3T3-E1 细胞进行刺激，结果表明MC3T3-E1 细胞的黏附和增殖能力增强，细胞内Ca2+浓度增加，其机制可能与L 型钙离子通道开放和Cav1.2 蛋白增加有关。Puts等[21]研究LIPUS 对饥饿小鼠骨样细胞存活的影响，用聚焦LIPUS 刺激10 min 后，细胞生长和存活基因及与细胞间通讯相关基因的表达增强，细胞活力得到改善。

LIPUS 促进BMSC 迁移也得到实验证实。Chen 等[22]将LIPUS 预处理后的BMSC 注射到大鼠股骨缺损部位，结果表明LIPUS 可以促进BMSC迁移，提高骨缺损愈合率，其机制可能与黏着斑激酶（FAK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2 信号通路激活有关。Wang 等[23]研究发现，BMSC 在LIPUS 的刺激下可以向牙槽骨缺损区迁移和归巢。Xia 等[24]研究发现，LIPUS 刺激可以显著激活细胞自噬，增加基质细胞衍生因子（SDF）-1 和趋化因子受体CXCR4 的表达，促进BMSC 迁移。此外，超声可以激活机械感应-整合素蛋白，促进活化的整合素与黏着斑结合，从而促进细胞骨架与细胞外基质之间的连接[25]。

2 促进成骨分化

研究发现，LIPUS 刺激可以促进成骨分化，增加Ⅰ型胶原蛋白（COL1）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、骨形态发生蛋白（BMP）-2、骨桥蛋白（OPN）、Runt 相关转录因子（RUNX）2 和成骨细胞特异性转录因子Osx 等的表达[26-27]。Jin 等[28]研究发现，LIPUS 可以在0.5%（v/v）脂质微泡的存在下增强聚乳酸-乙醇酸/α-磷酸三钙3D 打印支架上BMSC 的生长和成骨分化能力。Tang 等[29]用LIPUS 刺激苎麻基羧甲基纤维素，两者的协同作用进一步促进了MC3T3-E1 细胞增殖和成骨分化。Setoguchi 等[30]研究发现，LIPUS 与BMP-9 联合作用可以显著增加去分化脂肪细胞的成骨分化，但这种联合作用可以被吲哚美辛所抑制。Camarero-Espinosa 等[31]使用聚己内酯和聚乳酸制备了一种可降解的动态Janus 支架，其在LIPUS 的刺激下可以发生结构转变，并促进BMSC 增殖和成骨分化。Feng 等[32]比较1 MHz 和3.2 MHz 的LIPUS 对多孔钛合金支架的成骨作用，结果表明相较于对照组，1 MHz 频率组与3.2 MHz 频率组支架上细胞的ALP活性和OCN 水平均有所提升，但此两组之间差异并无统计学意义。Yao 等[33]制备了一种环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸修饰的纳米气泡，发现LIPUS可促进由肌动蛋白微丝聚合、瞬时受体电位M7（TRPM7）调节和细胞外Ca2+内流诱导的BMSC 成骨分化。

3 促进骨矿化与骨整合

LIPUS 被证明是促进体内外骨矿化的有效手段。Maung 等[34]用LIPUS 对小鼠骨膜来源细胞进行处理，尽管未观察到细胞增殖，但ALP 活性显著增加，并有矿化结节形成。Jiang 等[35]用强度为100 mW/cm2的LIPUS 刺激脂肪干细胞，发现其可在体外诱导脂肪干细胞矿化结节的形成，并增加成骨相关基因和骨唾液蛋白的表达。Zhou 等[36]研究发现，用LIPUS 刺激聚乙二醇二丙烯酸酯3D打印支架3 周，支架内钙沉积量增加10%以上。Kuang 等[37]研究证实，LIPUS 在体外对多孔陶瓷支架中的牙囊细胞具有促进骨矿化的作用。而Das等[38]研究证实，在体外用超声波刺激压电聚乳酸纳米纤维支架可以增强支架中BMSC 的成骨分化，从而改善骨矿化。Feng 等[32]的体内实验表明，LIPUS 刺激3 周及6 周后，接种有MC3T3-E1 细胞的钛合金支架钙沉积量增加。

LIPUS 主要在早期促进体内植入物骨整合[39-40]，有学者推断其促进植入物骨整合可能与降钙素基因相关肽α 的合成和分泌有关[41]。Liu 等[42]使用LIPUS 干预兔股骨和胫骨钛合金植入物，3 周后植入物周围骨组织密度、骨体积分数及骨小梁厚度均显著增加。Cao 等[43]测量接种有MC3T3-E1 细胞的钛合金支架孔隙占有率，发现经LIPUS 处理3 周和6 周后，支架孔中新生骨体积更大。Ruppert等[44]将LIPUS 与局部振动器所产生的低幅度、高频振动进行对比，结果发现经LIPUS 刺激4 周，可促进大鼠股骨钛合金植入物周围骨整合，该作用较振动刺激器产生的效果更为显著，而刺激8 周后两者差异并不明显。Zhou 等[45]用LIPUS 对卵巢切除大鼠股骨植入物进行处理，2～4 周后钛植入物周围骨的骨体积分数及植入物骨结合率显著提高，证实LIPUS 能有效促进骨质疏松骨组织中钛合金植入物的骨整合。此外，Chen 等[46]发现，LIPUS与脂肪源性基质细胞的结合可以促进兔髌骨与髌腱连接处的骨再生，愈合部位骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数均显著增加。

4 控制BTES 内生物活性分子及药物的释放

超声波因其显著的组织穿透能力而非常适合作为植入物的刺激触发器，这种高频率振动波所产生的机械效应可以控制声响应BTES 中生物活性物质及药物的释放速率，从而对骨再生产生有益影响[47]。Kennedy 等[48]开发了一种超声波可爆破的海藻酸盐壁胶囊以封装BMP-2 功能化修饰的金纳米颗粒溶液，当胶囊受到超声波冲击后，胶囊内金纳米颗粒几乎100%释放，并诱导BMSC 的成骨分化。Zhu 等[49]将掺有BMP-2 负载微球的聚乳酸/聚乳酸-乙醇酸/聚己内酯复合支架植入骨坏死部位，发现LIPUS 刺激可以促进微球中BMP-2 的释放，使得复合支架周围新形成骨的骨密度、矿化程度和成骨蛋白表达均得到显著改善。Moncion 等[50]制备了一种掺有负载碱性成纤维细胞生长因子的全氟化碳纤维蛋白水凝胶，水凝胶暴露于超声波会导致全氟化碳结构破坏，并加速碱性成纤维细胞生长因子的释放速率，从而刺激骨缺损周围血管生长。He 等[51]设计了一种由聚乳酸、海藻酸盐和Ca2+交联形成的声学响应支架，该支架中封装了SDF-1 和BMP-2；脉冲超声作用后，支架中Ca2+依赖性交联被破坏，加速支架降解并释放SDF-1和BMP-2，从而将宿主内源性BMSC 募集并捕获到骨缺损部位。另有研究报道，超声波作用可使BTES 内固体颗粒尺寸更小且分散程度更高，这也可能是BTES 内颗粒得以更好发挥作用的原因[52-53]。

5 抗菌及抑制植入物炎症反应

超声波可以在声敏剂存在的情况下发挥有效的抗菌作用[54]。Wu 等[55]开发了一种金纳米颗粒修饰的钛酸钡压电纳米复合材料，超声波刺激后该纳米复合材料的抗菌效率可达99.23%，并能促进金黄色葡萄球菌感染伤口的愈合。此外，超声波与其他物理刺激的协同作用可以进一步提高抗菌效果[56]。Zeng 等[57]在钛植入物表面覆盖由黑磷和聚多巴胺组成的复合涂层，依次用超声波和近红外光对该涂层刺激10 min 和20 min 后，其表现出较高的抗菌活性（97.3%），并可显著促进体外成骨和体内植入物的骨整合。

植入物植入骨缺损部位后会引起一系列免疫排斥反应。首先大量蛋白质分子在支架附近聚集，募集免疫细胞（中性粒细胞）并促使炎症因子释放，从而诱导急性炎症反应[58]。在慢性炎症期间，巨噬细胞聚集并形成异物巨细胞，它可以降解支架表面的生物材料，从而影响生物相容性。炎症反应消退后，大量肉芽组织形成，随后转变为纤维包膜，大量的纤维组织占据骨缺损部位，阻碍骨再生[59]。超声波在抑制骨植入物炎症反应中的作用已被证实。此外，LIPUS 可抑制脂多糖诱导的p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化并延缓局部肌肉萎缩[60]，促进细胞外基质合成，抑制核因子（NF）-κB信号通路激活，从而抑制炎症反应[61]。Wu 等[62]研究显示，LIPUS 刺激后的极化钛酸钡/钛合金支架周围组织中出现高比例的CD68 CD206 M2 型巨噬细胞，极化钛酸钡/钛合金支架可以通过抑制MAPK/c-Jun 氨基末端激酶(JNK)信号通路并激活巨噬细胞中的氧化磷酸化和三磷酸腺苷（ATP）合成来调节免疫微环境。

6 植入支架超声成像

植入支架体内环境的评估对于其临床转化起至关重要的作用[63]。Kim 等[64]在小鼠模型中首先使用了超声弹性成像来评估聚（1,8-辛二醇-柠檬酸酯）支架降解，发现支架弹性模量与支架重量损失（降解）相关。随后，Park 等[65]和Zhou 等[66]分别用超声弹性成像评估聚氨酯组织结构降解和聚乳酸-乙醇酸原位成型植入物降解。Prada 等[67]通过超声波在猪颅骨缺损模型中实现了对聚烯烃基聚合物假体的成像。Harvestine 等[68]将BMSC 封装在海藻酸盐水凝胶中并在成骨条件下培养4 周，使用荧光寿命成像和超声反向散射显微镜对其进行评估，线性回归分析确定了成像参数（如荧光寿命、声衰减系数等）与生化测试之间的强相关性，以此证明了超声波应用于骨组织工程植入物成像的可行性。Melchor 等[69]将接种人软骨细胞的3D打印聚乳酸支架放入超声波集成的生物反应器中培养，通过对超声波信号的分析，从而实现对软骨组织形成过程的无创实时监测。

7 结语

超声波作为一种兼具机械刺激和成像功能的技术，对骨组织工程具有十分积极的影响。LIPUS更是因为操作方便、疗效确切等优势被批准用于临床治疗骨折和骨不连，这为日后LIPUS 响应性BETS 走向临床提供了无限可能。然而，由于组织工程材料种类各异，LIPUS 各项参数（频率、强度和时间）的最佳值未能确定，这是未来需进一步研究的方向。此外，尽管大量研究已证实LIPUS对骨再生有利，但LIPUS 对BETS 本身的作用及其机制还有待进一步研究，这将为新型LIPUS 响应性材料的开发提供思路。