工程化益生菌活菌制剂在疾病治疗中的研究进展

贺鼎元,何东升,涂家生

(1.中国药科大学药学院药用辅料及仿创药物研发评价中心,江苏 南京 210009;2.国家药品监督管理局药物制剂及辅料研究与评价重点实验室,江苏 南京 210009)

益生菌作为对人体能产生健康功效的活性微生物补充剂,与人们的生活关系密切,在食品、药品和动物饲料等多个领域已经得到广泛应用。益生菌可在呼吸道、泌尿生殖道和肠道定植,并调控人体各部位菌群,进而调节乳糖代谢、钙吸收、维生素合成,以及抑制癌变等[1-2]。关于益生菌的研究已经在全世界开展了数十年之久,由于基因编辑技术的迅速发展与基因工程相关试验成本的降低,目前已可更便捷地实现益生菌的定向工程化改造,使其具有特定的治疗功能[3]。近年来,如脂质体包裹纳米酶涂层修饰的工程化益生菌应用于溃疡性结肠炎治疗[4]、基因工程改造乳酸乳球菌分泌β-内酰胺酶进而治疗艰难梭菌感染[5]等多种治疗策略的出现,都展示了益生菌制剂的广大前景。

1 益生菌活菌制剂的优势

益生菌活菌制剂继承了益生菌本身的安全性,同时易于改造以发挥新功能,另外还具有独有且优异的目标病灶靶向性及组织留存能力,这让益生菌活菌制剂在疾病治疗方面显示出了巨大的潜力[6-7]。

1.1 基因组庞大,便于改造益生菌具有庞大的基因组,便于进行基因工程改造。以嗜酸乳杆菌为例,其基因组大小在1.99 Mb左右,基因数目约1 927～1 948,蛋白数目约1 832～1 845,庞大的基因组和蛋白数目使其适合作为基因工程化改造的原材料[8]。除传统电激法、热激法质粒导入外,近年来CRISPR等基因编辑技术的迅速发展也使目标工程化益生菌的制备更为高效便捷。通过基因编辑技术对现有益生菌进行改造,可以直接验证这些新型微生物的遗传物质、蛋白质和功能作用是否发生了预期的改变。Zhou等[9]利用外源性Ⅱ型CRISPR-Cas9系统和内源性I-B型CRISPR-Cas系统进行了无缝基因组工程的研究,而这种高通量基因组工程工具的应用除了为益生菌改造提供便利外,也对从基因组学角度来探究益生菌对宿主产生益处的机制有着重要意义。此外,益生菌表面的细胞膜和细胞壁可进行修饰以携带多种元件,使其成为更加多功能化的药物载体。在益生菌表面利用沉积法形成双分子脂质涂层以及自组装丝素蛋白纳米涂层用于保护细菌载体等相关设计思路在国内外均有报道[10-11]。

1.2 生长简单可控,培养技术成熟益生菌的生长简单可控,具有培养技术成熟高效和培养成本较低的优点。目前益生菌的培养技术已经趋于成熟,益生菌繁殖迅速、成本低廉和操作简便的优点使其相较于其他传统纳米药物载体而言更加易于获得,在载体设计与前期预实验的进行上更为高效。而益生菌本身作为一类常被用于食品中的安全的添加剂,对人体健康益处已在食品上得到验证,因此其在安全性方面具有明显的优势[12]。

1.3 对肿瘤微环境存在靶向性在不同种类肿瘤的肿瘤微环境中,存在乏氧或富氧的不同情况,而益生菌中也存在好氧菌和厌氧菌,这让益生菌形成了天然的肿瘤微环境靶向性。以丁酸梭菌、鼠李糖乳杆菌为代表的厌氧益生菌具有主动靶向乏氧肿瘤微环境的潜质,而枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等好氧型益生菌则具有靶向富氧肿瘤微环境的潜质。除了利用肿瘤微环境富氧/乏氧特性实现靶向外,部分益生菌(如嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌)由于具有一定胃肠道耐受能力与定植能力,在进行工程化改造后可以设计成具有胃肠道主动靶向功能的口服药物递送载体[13]。

2 工程化益生菌活菌制剂在疾病治疗中的应用

工程化益生菌活菌制剂本身不仅具有较大的空间作为药物的载体,作为益生菌还具有调控菌群的功能,同时还可作为生产平台在原位表达多种具有治疗作用的组分,因此其在药物制剂领域和疾病治疗中的应用前景十分广阔[3,14-15]。

2.1 工程化益生菌用于治疗细菌感染细菌感染通常使用抗生素进行治疗,然而抗生素的过度使用会造成人体内细菌耐药增强,经抗生素筛选后存活的具备耐药性的“超级细菌”的繁殖会导致肠道菌群失衡,进而导致乳糜泻、脓毒症、炎症性肠病、肝脏甚至胰腺相关炎症的产生[16]。在面对类似问题时,工程化益生菌为细菌感染的治疗提供了新的思路。

艰难梭菌感染(clostridium difficile infection,CDI)一般是由产毒素艰难梭菌过度繁殖导致肠道菌群失调并释放毒素所引起的,其临床表现多样,从无症状的携带者状态,到不同程度的腹泻,再到最严重的威胁生命的结肠炎,最终导致死亡[17]。常用的对CDI的诊断手段是使用酶免疫分析进行检测,然后结合万古霉素、非达霉素等抗生素进行治疗[18]。Chen等[19]对布拉迪酵母菌进行了工程化改造,使其分泌一种单一的四特异性抗体,该抗体能有效和广泛地中和CDI的主要毒力因子(TcdA毒素和TcdB毒素),对抗疾病而不引起抗生素耐药性。在对小鼠疾病模型的预防和治疗实验中,该工程菌证明对原发性和复发性CDI具有保护作用。这种工程化酵母菌免疫疗法具有能够与抗生素联用的优点,有作为CDI风险预防药物和CDI患者治疗药物的潜力。此外,已被认证对人体安全的布拉迪酵母菌用于递送时,可以使用口服给药,这种方便而高顺应性的给药方式也让这个治疗方案相比传统药物载体介导的免疫疗法有着明显的优势。

李斯特菌是最致命的食源性病原体之一,可造成二至三成的感染者死亡[20]。Bhunia团队设计了可以产生李斯特菌黏附蛋白的工程干酪乳杆菌菌株,该菌株在小鼠肠道定植,竞争性地减少李斯特菌的黏膜定植和全身传播,保护小鼠免受致命感染。它们还可以通过聚集肠黏膜调节性T细胞、CD11c+树突状细胞和自然杀伤细胞来增强肠免疫调节功能[21]。这种基于配体-受体结合机制来设计的抗感染策略更为直接有效,也具有更好的生物安全性。菌株与肠道上皮细胞的近距离接触和接近增加了与宿主相互作用的机会,从而更好地执行接触依赖机制(竞争排斥和免疫调节),以发挥其预期的有益作用。

2.2 工程化益生菌应用于病毒感染治疗在病毒感染治疗方面,工程化益生菌主要通过在原位表达抗病毒因子而发挥治疗作用,也得到了广泛的应用。针对HIV感染,Petrova等[22]构建了工程化鼠李糖乳杆菌表达HIV抑制剂用于HIV的治疗。他们首先分别在鼠李糖乳杆菌GG和GR-1中表达Actinohivin(AH)和Griffithsin(GRFT)两种抑制HIV的凝集素,分别用于胃肠道和阴道黏膜递送,并研究GRFT在胞内的表达情况。该研究成功构建了能够生产GRFT的重组鼠李糖乳杆菌GG和GR-1菌株。在nisA启动子诱导下,观察到重组GRFT表达水平最高,证明了对M型和T型HIV-1病毒株的抗HIV活性。该研究开发了一种有效的基于工程化微生物的抗HIV-1药剂,使用鼠李糖乳杆菌GG和GR-1作为治疗蛋白的载体获得了较好的效果,这项工作代表着关于抗艾滋病凝集素原位高效表达的研究迈出了重要的一步。针对小鼠诺如病毒感染,Hoang等[23]构建了工程化副干酪乳杆菌进行了研究。该研究首先对鼠源的具有潜在抗病毒活性的3D8单抗的编码序列进行密码子优化,将其导入副干酪乳杆菌中使其能够分泌3D8单抗(3D8 scFv),并对该单抗对胃肠道病毒感染的抗病毒作用进行评价。结果表明,新构建的工程化副干酪乳杆菌分泌的3D8 scFv保持了穿透细胞和核酸水解活性。使用提取的3D8 scFv来预处理RAW264.7细胞,可防止小鼠诺如病毒感染诱导的细胞凋亡,降低病毒衣壳蛋白VP1 mRNA的表达。小鼠模型中,在小鼠诺如病毒感染前口服工程化副干酪乳杆菌可使编码病毒聚合酶mRNA的表达水平降低20.1倍。综上所述,这些结果表明,可分泌3D8 scFv的副干酪乳杆菌为开发可摄入的抗病毒益生菌提供了抗胃肠道病毒感染的基础。

2.3 工程化益生菌应用于肿瘤治疗工程化益生菌的潜在多功能修饰特性为其在肿瘤治疗中提供了多种可能,如通过调节肠道菌群及利用自身靶向作用等特点,为肿瘤的治疗提供了新的思路。为了实现治疗目的,工程化益生菌制剂的构建主要通过两种策略:一是将益生菌包裹于载体材料内;二是将治疗性药物装载于益生菌内部,而将益生菌作为载体[24]。

将益生菌包括与载体材料中,可以利用载体材料的可修饰特性赋予益生菌新的功能。Zheng等[25]利用β-环糊精和金刚烷介导的主客体相互作用,将葡聚糖包裹在丁酸梭菌孢子外部制备了益生菌孢子(孢子-dex),并探究了其在结肠癌治疗中的应用。在肠道的厌氧环境中,孢子-dex会复活,分解葡聚糖,并特异性地富集在肿瘤组织中。葡聚糖的引入改善了肠黏附,促进了丁酸梭菌的发酵,进而产生大量的抗癌短链脂肪酸。此外,益生元的易修饰性也提供了与卡培他滨和双氯芬酸等负载药物联合治疗的可能性。重要的是,这项研究表明,孢子-dex能系统地调节肠道微生物群,从而将肠道微生物群从促肿瘤转变为抗肿瘤类型,可为胃肠道疾病的新疗法设计提供参考。

益生菌的安全性和内部空间使其可以作为良好的药物载体。Xie等[26]构建了趋磁益生菌负载光热治疗剂并开展了用于肿瘤治疗的研究。他们提出了一种将药物加载到益生菌中的递送策略,通过电穿孔将化疗药物5-氟尿嘧啶和巨噬细胞表型调节剂唑来膦酸装入大肠杆菌Nissle 1917(EcN)中,然后在EcN表面装饰金纳米棒来构建工程化益生菌。在近红外照射下,金纳米棒的光热效应提高了局部温度,内部药物逐步释放,实现了由外部开关来控制药物的释放,也是实现通过活细胞来实现对药物的控释。EcN的主动靶向促进了药物在肿瘤内渗出血管并蓄积的过程。这个治疗方案将化疗、免疫治疗和光热效应结合于一体,为益生菌作为靶向药物载体在肿瘤治疗中的研究提供了新思路。

2.4 工程化益生菌应用于炎症治疗在炎症治疗方面,工程化益生菌同样可通过原位表达特异性治疗分子以及肠道菌群的调节等方式来发挥作用。炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)分为两种亚型,即克罗恩病和溃疡性结肠炎,均与T细胞介导的对肠道细菌的免疫反应失调有关,是慢性复发缓解的胃肠道炎症性疾病。Zhou等[27]开发了一种能够在胃肠道内原位产生过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的工程益生菌[EcN-pE(C/A)2],并考察了他们在IBD中的治疗作用。他们设计了壳聚糖和海藻酸钠为组分的材料来包裹工程化益生菌,使口服工程益生菌具备胃肠道环境耐受能力。结果表明,口服EcN-pE(C/A)2可有效上调结肠组织紧密连接相关蛋白的表达水平,保护结肠上皮细胞免受炎症诱导的凋亡。动物实验结果表明EcN-pE(C/A)2的治疗能显著减轻葡聚糖硫酸钠盐(DSS)诱导的急性IBD,具体表现包括体重恢复、结肠黏膜组织损伤恢复和结肠髓过氧化物酶活性降低。结果表明,口服这种包被的工程化益生菌对急性IBD的治疗是安全有效的。在口腔炎症方面,Silva等[28]使用分泌人三叶因子1(hTFF1)的基因对乳酸乳球菌进行了工程化改造,并在临床中配制成漱口液用于治疗口腔黏膜炎症。结果表明,局部给药工程化乳杆菌来原位分泌hTFF1为口腔黏膜炎的预防和治疗提供了一种安全有效的工具。值得一提的是,安全性研究结果也支持对有发生中性粒细胞减少风险的口腔黏膜炎患者安全给药,这将大大降低此类患者因口腔黏膜损伤诱发菌血症的额外风险。这项研究的结果对于口腔黏膜炎症这一重要且目前仍未被满足的医疗需求而言具有重大临床意义。

2.5 工程化益生菌应用于其他治疗领域除了细菌与病毒感染、肿瘤、炎症这些较为热门的治疗领域外,工程化益生菌活菌制剂还能为许多其他疾病的治疗提供方便和有益的平台。

在代谢性疾病方面,随着高嘌呤饮食消费的增加,高尿酸血症已经成为继糖尿病之后的第二普遍的代谢性疾病,而人体内缺乏尿酸氧化酶,无法将尿酸进一步代谢。体内多余的尿酸通过肾脏和肠道排出,因此,肠道微生物可能为治疗高尿酸血症提供一种新的方式。Zhao等[29]构建了含有编码枯草芽孢杆菌尿酸盐代谢蛋白PucL和PucM、编码大肠杆菌尿酸盐转运蛋白YgfU和过氧化氢酶KatG以及编码透明颤菌细菌血红蛋白Vhb的质粒,将质粒导入EcN中。该工程化EcN能够在常氧和低氧条件下快速降解尿酸,能够实现肠道的定植,且无论胃肠道给药还是血液注射给药的方式都能够显著降低高尿酸血症小鼠的血尿酸浓度。研究结果支持肠道中应用工程化EcN菌株来治疗高尿酸血症的可行性,同时提出了直接向血液中注射工程化EcN菌株的新疗法,为使用工程化益生菌治疗代谢紊乱类疾病提供了新思路。

肠-脑轴的发现已经证明,大脑功能会受到肠道微生物群代谢物的影响,因此利用工程化益生菌来调节肠道微生物群从而对大脑功能的调节具有重要意义。基于肠道微生物群的肠-脑轴调节可用于神经退行性疾病的治疗。Pan等[30]设计了3种蓝光响应益生菌,它们分别通过上转换光基因分泌GABA、GCSF或GLP1等物质构建成微纳米系统,从而进行对递送系统的时空传递和控制。该微纳米系统可促进小肠靶向和肠内外源性乳酸乳杆菌的产生,实现由肠道对焦虑行为、帕金森病、迷走神经传入等脑功能的精准操控。已有研究表明,口服GABA能够缓解小鼠的焦虑样行为[31]。本实验设计并构建了光照下能分泌具有生物活性的GABA的乳酸乳球菌,口服递送工程化益生菌并用上转化光照射后,结果表明,该实验成功利用基于微生物的肠-脑轴调节实现了对焦虑的精确调节。值得一提的是,这项设计中使用的上转化光照射触发响应的方法比起在肠道插入光纤的传统方法,避免了肠道组织的损伤,可控性也更强。此外,该实验还通过相同的原理构建了能通过光照触发响应分泌在PD恢复过程中的神经保护和神经功能恢复中发挥作用的GCSF、作用于肠神经系统(ENS)中的GLP1受体的GLP1等多种工程化光照响应型益生菌,并取得了较为理想的治疗效果。这种无创、实时的益生菌干预策略使肠道菌群与宿主的交流更加可控,为工程微生物准确、有效地调口服活生物治疗剂的设计方案结合了纳米技术和基因工程的进展,在微生物治疗的临床应用方面有着巨大应用前景。

3 总结与展望

近年来,工程化益生菌领域的发展非常迅速,得益于CRISPR等相关基因编辑技术的发展和工程菌基因编辑平台的构建,益生菌的工程化改造变得更加便捷高效,不断拓展了工程化益生菌的应用。但是,工程化益生菌活菌制剂仍然存在一定的局限性。例如,由于益生菌主要定植在肠道部位,目前其在疾病治疗中的应用仍以肠道部位疾病为主,将益生菌应用于人体其他部位疾病治疗仍有一定难度。虽然基于肠-脑轴调节的研究使基于工程化益生菌的生物治疗方案在神经退行性疾病的治疗中显示出巨大的潜力,为拓宽工程化益生菌的应用提供了有益的证据,但工程化益生菌与宿主相关大脑功能之间的远程调节关系仍有待进一步探索。

目前FDA仍将益生菌归类为膳食补充剂,对益生菌相关制剂的剂量、疗效、安全性的要求并不严格。但是,益生菌活菌制剂设计研发过程中常常涉及到对益生菌进行基因工程改造以使其具备治疗作用,在这一过程中获得抗生素耐药基因的益生菌有可能将耐药基因转移给邻近的病原微生物。因此,在制备得到益生菌活菌制剂后,有必要加强相关研究,对其制剂和微生物的稳定性、在肠道上皮中的定植、抗致病反应、免疫激活等重要功能指标进行相应检测,并进行深入探讨。此外,针对益生菌改善肠道菌群丰度的生物原理尚不明确,仍需结合蛋白组学相关研究以进一步实现益生菌作为治疗药物的应用。

总之,工程化益生菌具有稳定性、特异性、选择性、成本低、相对安全等优点,可能成为癌症、炎症、感染等不同类型疾病治疗的新方法,同时在罕见疾病的诊断和治疗方面具有巨大潜力,有望成为疾病治疗和药物制剂领域新的选择。