细菌外囊泡的研究进展

郭金荣,雍浩蕾,贺雅宁,李沐晓,王丽梅

细菌外囊泡(bacterial extracellular vesicles, BEVs)是由细菌分泌的、直径为10～450 nm的球形双层膜结构,其内携带有母源细菌来源的外膜蛋白、周质蛋白、肽聚糖、脂多糖、磷脂、DNA、RNA和毒性因子等物质,被认为是一种特殊形式的细菌分泌[1-2]。

1965年,研究人员在一株营养缺陷的大肠埃希菌的电子显微镜图像中,首次观察到BEVs的产生[3]。随后几十年,由于革兰阳性(Gram-positive, G+)菌细胞壁较厚,被认为较难分泌BEVs,研究一直集中于革兰阴性(Gram-negative, G-)菌的BEVs。直到2009年,Lee等[4]才从金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的培养上清液中分离出G+菌的BEVs。随后,在古细菌中也发现有BEVs。BEVs在细菌的发生和进化中扮演着重要的角色,而且与人的正常生理功能和疾病的发生发展也具有密切的关系。本文从BEVs在细菌的环境耐受、防御作用、信号交流、物质运输以及细菌对宿主的免疫调节和发病机理等方面,对当前的BEVs研究进展进行了全面的综述,为BEVs的相关研究提供有用参考。

1 BEVs的发生机制和结构组成

不同细菌来源的BEVs,其生物发生途径不同,且具有不同的结构和组成。

1.1 G-菌的BEVs G-菌的BEVs主要通过两种途径生成,即通过细菌外膜(outer membrane, OM)的起泡生成或通过细菌裂解产生[5-6]。由此,G-菌的BEVs可分为由外膜起泡产生的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)和外-内膜囊泡(outer-inner membrane vesicles, OIMVs),以及细菌裂解产生的外膜囊泡(explosive outer-membrane vesicles, EOMVs)和外-内膜囊泡(explosive outer-inner membrane vesicles, EOIMVs)。

1.1.1 OMVs和OIMVs OMVs为一种球形颗粒,由内外两小叶构成。内小叶由磷脂组成,外小叶由脂多糖、外膜蛋白和膜出芽起泡过程中捕获的周质蛋白组成[7]。OMVs是由于细菌外膜紊乱,如肽聚糖生物合成不平衡导致细菌OM与肽聚糖间的交联减少,周质间隙中错误折叠蛋白质或包膜成分的积累,脂多糖分子之间的阴离子电荷排斥以及疏水分子嵌入OM等因素,引起OMVs的产生[5,7]。所以,OMVs富含周质蛋白、外膜蛋白和OM特定的脂质。然而,OMVs随着细菌生长阶段和条件的不同,其携带的成分和含量也存在差异[8-9]。

OIMVs的发生是由于细菌自溶酶降解肽聚糖层后,细菌内膜突出到周质间隙,伴随胞质内容物进入囊泡并最终与周围的OM一起被挤压出去,从而产生OIMVs[10]。OIMVs包含DNA、RNA和ATP等细胞质成分。不同细菌产生的OIMVs含量,在细菌分泌产生的总BEVs含量中所占的比例差异较大。如研究发现,囊状希瓦氏菌M7产生的OIMVs只占其总BEVs的大约0.1%,而海假交替单胞菌产生的OIMVs占其总BEVs的49%左右[11-12]。

1.1.2 EOMVs和EOIMVs 这两种BEVs的生物发生机制是由于细菌DNA损伤应激,诱导前噬菌体来源的内溶素表达,从而降解细菌肽聚糖层并破坏细胞壁,从而导致细菌爆炸,出现膜碎片聚集并自组装形成EOMVs和EOIMVs[13-14]。EOMVs和EOIMVs也含有细菌细胞质成分和基因组DNA。研究发现,囊状希瓦氏菌M7在生长指数后期到稳定期阶段,会产生EOMVs和EOIMVs,而且其EOIMVs通常具有不同寻常的结构,如在一个较大的囊泡内有多个囊泡或不规则形状的内囊泡[15]。

1.2 G+菌的BEVs 研究证实,G+菌在不同条件和自然环境下都会产生BEVs,大小在10～450 nm之间。G+菌的BEVs的发生机制类似于G-菌通过发生裂解产生BEVs的机制,是由缺陷前噬菌体编码的内溶素降解肽聚糖层,破坏细胞壁,导致菌体发生肿胀,细胞膜包裹的细胞质内容物向外膨出而形成。所以,G+菌的BEVs,又常被称为细胞质膜囊泡(cytoplasmic membrance vesicles, CMVs)[16]。由于G+菌在此过程中并未完全解体,但细胞质膜完整性的丧失可导致部分细菌死亡,因此这一机制又被称为“起泡细胞死亡”。

1.3 特殊类型的BEVs 管状膜结构(tube-shaped membranous structures, TSMSs)是一种特殊类型的BEVs,又被称为纳米管、纳米丝或纳米颗粒。目前对于TSMSs的形成机制尚不完全明确,一般认为TSMSs是由G-菌的OM或G+菌细胞质膜的管状突起而形成。结构最简单的TSMSs是由OMVs串联而形成[5]。部分细菌还可将串联的OMVs进一步融合形成纳米管结构,如土拉弗朗西斯菌可在液体介质中产生OMVs和TSMSs。OMVs与TSMSs之间还可以相互转化,OMVs能够串联融合形成纳米管,而纳米管也可分解形成OMVs[17]。

2 BEVs的生物学功能

BEVs是细菌的一种特殊形式分泌[1-2],在细菌的自身调节和细菌—细菌之间相互作用中发挥着重要功能。但由于不同来源的BEVs含有的内容物不同,因而也发挥着不同的生物学功能。

2.1 摄取营养物质 BEVs内含有水解酶,可催化降解环境中存在的蛋白质和复合多糖,帮助细菌摄取营养物质[18]。此外,BEVs中还具有铁载体、锌载体、氨基酸和脂肪酸转运系统等,从而促进细菌对相关营养物质的摄取。如结核分枝杆菌分泌的BEVs携带分枝菌素,可帮助结核分枝杆菌远距离获取宿主中的铁成分,促进结核分枝杆菌的生长[19]。

2.2 防御作用 BEVs可通过环境耐受、抑制抗生素的杀菌作用、拮抗噬菌体的作用等多种机制增强细菌对外界环境的防御能力。其一,在应激情况下,细菌可以通过调节BEVs的产量和内容物,以此缓解由错误折叠蛋白、肽聚糖片段或脂多糖在周质间隙积累而引起的膜应激反应[20]。如温度过高会导致蛋白质变性,从而引起细菌外膜流动性增加,BEVs的分泌也随之增加[21]。铁缺乏、氧化应激、酒精和盐等环境刺激也均会影响BEVs的分泌[22]。其二,BEVs来源于细菌膜成分,可以保护细菌免受某些抗生素的侵害。研究证实,在抗生素环境中,分泌BEVs的细菌比不分泌的细菌存活时间更长。BEVs可通过结合、降解和排放等途径作用进入菌体中的抗生素,从而提高细菌对抗生素的防御力。如流感嗜血杆菌分泌的含β-内酰胺酶的BEVs,能够水解阿莫西林,保护A组链球菌免受阿莫西林的杀菌作用[23]。当鲍曼不动杆菌处于亚抑菌浓度的左氧氟沙星环境时,可以通过高外排泵的表达和BEVs的分泌,排出大量负载的抗生素囊泡,从而阻止抗生素的杀菌作用[24]。BEVs也可通过包裹的耐药质粒,将抗生素抗性基因水平传递到其他细菌,从而增强细菌对抗生素的杀伤作用。如鲍氏不动杆菌可通过OMVs将β-内酰胺酶基因blaOXA-24传递给其阴性株,而使其获得青霉素和头孢类抗生素的抗性[25],从而增强鲍氏不动杆菌群落细菌对抗生素的抵抗力。其三,BEVs既可作为靶标吸引噬菌体的攻击,又可作为将噬菌体传递给其他细菌的载体,进而扩大噬菌体的感染范围[26]。如大肠埃希菌BEVs可结合并灭活大肠埃希菌特异性T4噬菌体,从而降低环境中噬菌体的细菌感染率[27]。

2.3 信号交流 BEVs可参与生物被膜的形成:细菌释放BEVs时,可导致细胞表面疏水性的增加,从而增强生物膜的形成,同时BEVs也可作为细胞外DNA的成核位点或者通过提供有益的蛋白如血红素利用蛋白HmuY,促进生物膜的形成[28]。研究发现,幽门螺杆菌可被其分泌的BEVs诱导形成生物被膜,但具体机制尚不清楚。变异链球菌分泌的BEVs不仅可促进其自身生物被膜的形成,而且还有利于白色念珠菌生物被膜的形成[29]。BEVs可传递、释放毒力因子:G-菌分泌的BEVs中包含的大部分蛋白为酶、分子伴侣、毒力相关蛋白等毒力因子,且这些毒力因子在BEVs中的半衰期延长,因此BEVs在毒力因子的传递释放中具有重要作用。研究表明,铜绿假单胞菌分泌的BEVs通过与宿主质膜中的脂筏融合,可直接将β-内酰胺酶、碱性磷酸酶、溶血磷脂酶C等多种毒力因子传递到宿主细胞质内,影响宿主细胞的生物学功能,从而避免病原体和宿主细胞直接相互作用引起的细胞毒性作用[30]。此外,肠出血性大肠埃希菌分泌的BEVs,其包裹的溶血素比游离的溶血素更稳定,前者半衰期长达20 h,而后者半衰期仅15 min[31]。BEVs可提高细菌群体竞争力:群体感应是一种细菌间通讯机制,允许细菌相互交流,是许多病原菌毒力的重要驱动力[32]。BEVs内所含的特异性酶能够区分自身菌和非自身菌,进而靶向根除非自身菌,提高自身菌在环境中的竞争力。如铜绿假单胞菌分泌的BEVs通过递送细胞壁蛋白水解酶降解肽聚糖而杀死竞争性细菌;嗜酸乳杆菌BEVs内的细菌素可使德氏乳杆菌和大肠埃希菌的生长受到抑制[33]。此外,共生菌特别是肠道微生物群可对宿主肠道进行免疫调节,共生菌分泌的BEVs可以杀死竞争细菌,影响竞争细菌产生细菌素,改善肠上皮屏障的功能,保护生态位,促进宿主免疫调节,从而为其亲本细菌提供选择优势[34]。另外还有研究发现,在同一生态空间中的竞争性细菌还可分泌抗生素到BEVs内,选择性地杀伤其他种属的细菌。部分细菌可将糖苷酶和蛋白水解酶通过BEVs传递给竞争细菌,将其杀灭以获取更多的营养物质[35]。

3 BEVs对宿主细胞的调节

BEVs能够介导细菌和宿主细胞之间的相互作用,参与调节宿主细胞的功能,进而导致细菌感染性疾病的发生和发展。目前对BEVs调节宿主细胞功能的研究主要集中于免疫调节、介导细胞死亡和诱导肿瘤发生等过程。

3.1 调节宿主细胞免疫功能 由于BEVs的特殊发生机制,通常会携带有病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)[36]。PAMPs可被宿主细胞的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)所识别,从而诱导宿主细胞免疫反应。如BEVs含有的脂多糖和脂寡糖能够被TLR4所识别,肽聚糖能够被核苷酸寡聚化结构域(Nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)蛋白1 (NOD1)和2 (NOD2)受体识别,从而激活NF-κB通路,介导促炎反应。BEVs含有的RNA可被宿主细胞的TLR7/TLR8所识别,激活NF-κB信号通路,促进IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-12等细胞因子的分泌[37-39]。另外,BEVs还可通过PAMPs激活宿主细胞的NLRP3、NLRC4和AIM2等炎症小体,从而诱导宿主细胞的炎症反应[40]。

BEVs还可诱发宿主细胞产生超敏反应,或者诱导免疫逃逸。Krisana A等[41]研究发现,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分泌的BEVs能够刺激小鼠体内IL-4、IL-5、IL-6等Th2相关细胞因子的产生,并导致小鼠发生过敏性休克,这表明BEVs可引发IgE介导的全身性超敏反应。鼠伤寒沙门菌分泌的BEVs携带PagC蛋白,可通过募集补体抑制因子H使C3b失活,从而逃避补体介导的杀伤[42]。

3.2 诱导宿主细胞死亡 BEVs可通过触发炎症小体的形成,激活焦亡效应分子GSDMD,从而导致细胞焦亡[43-44]。肠出血性大肠埃希菌分泌的BEVs可通过内吞作用进入宿主细胞,其表面的脂多糖能够与宿主细胞胞质内的caspase-11结合,从而直接激活GSDMD,活化的GSDMD可在宿主细胞膜上成孔,促进IL-1β和IL-18的分泌,导致宿主细胞焦亡[45]。BEVs也可通过直接影响线粒体的完整性或释放毒力因子以及减少促生存蛋白的合成等途径来诱导细胞凋亡[46]。研究发现,当鲍曼不动杆菌分泌的BEVs被宿主细胞内化后,其内的OmpA和Omp38可特异性地定位于线粒体,损害线粒体膜完整性,从而导致宿主细胞凋亡[47]。淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌分泌的BEVs能以非特异性的方式降低线粒体膜电位,并通过激活BAX和BAK蛋白、减少促生存蛋白BCL-2的合成来激活细胞凋亡[48]。

3.3 诱导肿瘤的发生 细菌在肿瘤的发生发展中如何发挥作用是目前研究的一个方向,但其作用机制还不完全清楚。目前越来越多的研究发现,BEVs传递的毒力因子能够诱导癌细胞系基因组的损伤。例如,Kim DJ等[49]发现,粪肠球菌和大肠埃希菌分泌的BEVs可能含有外毒素,且可以产生靶向宿主细胞DNA的自由基,导致宿主细胞染色体不稳定,从而促进肿瘤的发生。TurkinaMV等[50]发现,幽门螺杆菌分泌的BEVs携带CagA蛋白,可增加ATP对染色体中H1组蛋白的亲和力,导致基因组损伤,诱导肿瘤的发生。另外,BEVs携带的msRNA和sRNA可抑制宿主细胞mRNA的转录和翻译,或促进mRNA衰减,从而参与宿主细胞肿瘤微环境的调节[51]。

4 展 望

BEVs作为细菌的一种特殊分泌形式,其在细菌自身的调节、细菌-细菌之间和细菌-宿主细胞之间相互作用中,均发挥着重要的功能。因此,目前在研究BEVs生物发生机制和生物学功能的基础上,对于BEVs在细菌致病机制中的作用研究也越来越受到重视,成为BEVs研究的一个重要方向。此外,由于BEVs具有特殊的结构和物质组成,将BEVs作为新型疫苗和药物递送载体以及佐剂等的研究也正成为BEVs研究的一个新热点。相信随着对BEVs的不断探索,未来我们将对细菌的生长、进化和环境耐受等方面会有更深的认知,对细菌的致病机制和耐药性等方面也会不断有新的发现,而且随着对BEVs临床应用的探索,也将加快疫苗和药物载体的研发。BEVs的研究将为生命科学和医学的发展开辟一个全新的方向。

利益冲突：无

引用本文格式：郭金荣,雍浩蕾,贺雅宁,等.细菌外囊泡的研究进展[J].中国人兽共患病学报,2024,40(2):191-196. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.023