高良姜-广藿香配伍溶液的质量标准研究

李庄琦，薛千蓉，练秀霞，文 欢，邝杨君，张俊清，李海龙，王舒婷

（1.热带药物创新与转化教育部工程研究中心；海南省热带药用植物研究开发重点实验室；海口市黎族医药重点实验室；海南医学院药学院，海南 海口570100；2.海南普利制药股份有限公司，海南 海口 570100）

高良姜为姜科山姜属植物高良姜（Alpinia officinarumHance）的干燥根茎，味辛，性热，归脾、胃经，具有温胃止呕、散寒止痛的功效［1］。最早记载于《名医别录》［2］，广泛分布于我国广西、海南、广东等省区。高良姜素从姜科植物高良姜的干燥根茎中分离而得，作为一种天然的黄酮类化合物是高良姜的主要活性成分［3］。近年来药理研究表明，其具有抗胃溃疡、抗胃肠道出血、抗肿瘤、抗炎等作用［4-7］。广藿香为唇形科植物广藿香（Pogostemon cablin（Blanco） Benth），辛温，归脾胃、肺经。最早记载于《名医别录》［2］，广泛分布于广东、广西及海南等地。广藿香酮是广藿香的主要活性成分［8］。药理研究表明，广藿香酮具有化湿、解暑、止呕、调节胃肠道、抗癌、调节免疫等多种药理作用［9-12］，且藿香正气软胶囊在临床上曾被用于治疗糖尿病胃轻瘫［13］。2020版《中国药典》记载，高良姜温胃平逆，行气导滞，广藿香芳香化浊，和中止呕。两味中药均归于脾胃经，二者配伍针对糖尿病胃轻瘫功效协同且相辅相成。课题组目前正在采用现代药理学技术进行高良姜-广藿香配伍溶液针对糖尿病胃轻瘫的药效物质基础与作用机制研究。研究表明，配伍有高良姜、广藿香两味中药的胃病胶囊对寒凝气滞所致胃脘疼痛疗效尤好，并具有温胃散寒、理气止痛之功效［14，15］。因此，本研究采用现代色谱技术，从薄层色谱鉴别、主要指标性成分含量测定等方面较系统研究高良姜-广藿香溶液的质量标准，为高良姜-广藿香今后的健康产品及新药研发、中西医结合临床治疗疾病奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

ULtiMate 3000 液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司）；KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ZF-20D 暗箱式紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；良平仪器FA2204 电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；梅特勒XS105DU电子分析天平（梅特勒公司）；高效薄层硅胶板GF254（青岛海洋化工厂分厂、上海盛亚化工有限公司、烟台江友硅胶开发有限公司）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂分厂、青岛鼎康有限公司、青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）。

1.2 试剂与试药

高良姜素对照品（合肥博美生物科技有限责任公司，纯度≥98.0%），广藿香酮对照品（阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥98%）；高良姜配方颗粒（广东一方制药有限公司），广藿香配方颗粒（广东一方制药有限公司）；水为超纯水，甲醇、磷酸都为色谱纯，其余试剂都为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 高良姜-广藿香配伍溶液薄层鉴别项的建立 配伍溶液的制备：称取高良姜、广藿香配方颗粒，各0.5 g，加入5 mL 乙酸乙酯超声10 min，离心溶解后取上清液，作为高良姜素薄层鉴别用的配伍溶液。称取高良姜、广藿香配方颗粒，各0.5 g，加入2 mol/L 氢氧化钠溶液3 mL，用2 mol/L 盐酸溶液调节pH 值至2.0，再用6 mL 温度为60℃～90℃的石油醚提取，振摇分取石油醚层，浓缩至0.5 mL，作为广藿香酮薄层鉴别用的配伍溶液。

对照品溶液的制备：精密称定高良姜素对照品，加乙酸乙酯配制浓度为4.00 mg/mL 的高良姜素对照品溶液。精密称定广藿香酮对照品，加石油醚配制浓度为3.50 mg/mL 的广藿香酮对照品溶液。

高良姜素薄层鉴别方法：依据2020 年版《中国药典》薄层色谱法进行试验，取对照品溶液、配伍溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，石油醚-乙酸乙酯（5∶3）为展开剂，展开，取出并晾干，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，置于105 ℃下加热至斑点显色清晰，在日光下检视［16］。

广藿香酮薄层鉴别方法：依据2020 年版《中国药典》薄层色谱法进行试验，对照品溶液、配伍溶液各4 μL，分别点于同一高效薄层硅胶板上，石油醚-乙酸乙酯（5∶1）为展开剂，展开，取出并晾干，以5%三氯化铁乙醇溶液为显色剂，加热至斑点显色清晰即可［16］。

专属性试验：分别吸取高良姜素或广藿香酮对照品溶液、高良姜-广藿香配伍溶液及空白溶液（乙酸乙酯或石油醚），点于同一硅胶G 薄层板（或高效硅胶G 薄层板）上，按上述高良姜素和广藿香酮2 种指标性成分的薄层鉴别方法进行专属性试验，记录薄层色谱图。

稳定性试验：按上述高良姜素和广藿香酮2 种指标性成分的薄层鉴别方法，分别制备高良姜素或广藿香酮对照品溶液、高良姜-广藿香配伍溶液及空白溶液（乙酸乙酯或石油醚），制备后于0、2、4、6 d分别吸取高良姜素或广藿香酮对照品溶液、高良姜-广藿香配伍溶液、空白溶液（乙酸乙酯或石油醚）各溶液4 μL，点于硅胶G 薄层板或高效硅胶G 薄层板上，记录薄层色谱图。

耐用性试验：选择相同点样方式、不同厂家薄层板的试验方法进行考察，高良姜素的薄层鉴别试验选择青岛海洋化工厂分厂G 硅胶板、青岛鼎康有限公司G 硅胶板以及青岛海浪硅胶干燥剂有限公司G 硅胶板3 个厂家；广藿香酮的薄层鉴别试验选择青岛海洋化工厂分厂GF254 硅胶板、上海盛亚化工有限公司GF254 硅胶板及烟台江友硅胶开发有限公司GF254 硅胶板3 个厂家，点样后记录薄层色谱图。

高良姜-广藿香配伍溶液薄层鉴定：取高良姜、广藿香配方颗粒，根据“配伍溶液制备方法”配制以上2 味中药1∶1 的配伍溶液10 批，按照以上薄层鉴别方法点样，记录薄层色谱图。

1.3.2 高良姜-广藿香配伍溶液高效液相色谱法含量测定项的建立 配伍溶液的制备：精密称定高良姜和广藿香配方颗粒各1.0 g，置容量瓶中，加入5 mL 甲醇，密塞并称定质量，超声10 min 后放冷，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，静置后取上清液，滤过，取续滤液［16，17］，即得高良姜-广藿香配伍溶液。

混合对照品溶液制备：分别精密称取高良姜素、广藿香酮对照品，加甲醇配制成含高良姜素4.40 mg/mL 及广藿香酮3.02 mg/mL 的混合对照品溶液。

色谱条件：Ultimate XB-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸（B），检测波长为310 nm，梯度洗脱（0～5 min，45% A；5～15 min，45% A→55% A；15 min～25 min，55%A；25～45 min，55% A→90% A；45～50 min，90%A；50～55 min，90% A→45% A；55～60 min，45%A）；流速为1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL［18，19］。

专属性试验：依次吸取空白溶液（甲醇）、配伍溶液及混合对照品溶液各10 μL，按照色谱条件进样并记录色谱图［18］。

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液，配制高良姜素质量浓度分别为：10、20、100、200、500、1 000 μg/mL 的6 个浓度系列标准溶液；广藿香酮质量浓度分别为：10、20、80、160、320、640 μg/mL 的6个浓度系列标准溶液。分别进样10 μL［18］，记录色谱图。

精密度试验：取混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次并记录色谱图。

稳定性试验：精密称取供试品，配制配伍溶液，取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，分别在0、1、2、4、6、8、24 h 不同时间点进样10 μL 测定［18］，记录色谱图。

重复性试验：取同一批次高良姜和广藿香颗粒，配制6 份配伍溶液，每份配伍溶液取10 μL 溶液测定［18］，记录色谱图。

加样回收试验：精密称定高良姜、广藿香颗粒各1.0 g，置容量瓶中，加入甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理10 min，放冷，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，静置，后取上清液，滤过，取续滤液［16，17］即得高良姜-广藿香配伍溶液。精密吸取9 份已知含量的配伍溶液，分别精密加入低、中、高不同的浓度混合对照品溶液，每个浓度梯度3 份，各取10 μL 溶液进样测定［18］，记录色谱图、计算加样回收率。

高良姜-广藿香配伍溶液的含量测定：取10 批不同批次高良姜-广藿香颗粒，配制配伍溶液，进样测定并记录色谱图［18］。

2 结果

2.1 高良姜-广藿香配伍溶液薄层色谱鉴别项结果

专属性考察结果：由图中可见，在与高良姜素对照品溶液（1 号）斑点相对应的位置（Rf 为0.64），高良姜素薄层鉴别用的配伍溶液所呈现的斑点与对照品溶液颜色和位置一致，且空白溶液在相应位置未出现相同颜色的斑点，表明该方法专属性良好；广藿香酮对照品溶液（1 号）斑点相对应的位置（Rf 为0.59）广藿香酮薄层鉴别用的配伍溶液所呈现的斑点与对照品溶液所呈现的颜色和位置一致，且空白溶液在相应位置未出现相同颜色的斑点，表明该方法专属性良好。见图1、2。

图1 高良姜素专属性考察结果Fig 1 Specific results of galangin

图2 广藿香酮专属性考察结果Fig 2 Specific results of pogostone

稳定性考察结果：由图中可见，取高良姜素薄层鉴别用的配伍溶液于0、2、4、6 d 点样，斑点清晰可见，分离度较好，表明供试品溶液在6 d 内稳定性良好。见图3。

图3 高良姜素稳定性考察结果Fig 3 Stability inspection results of galangin

由图中可见，广藿香酮薄层鉴别用的配伍溶液于0、2、4、6 d 点样，斑点清晰可见，分离度较好，表明供试品溶液在6 d 内稳定性良好。见图4。

图4 广藿香酮稳定性考察结果Fig 4 Stability inspection results of pogostone

耐用性考察结果：采用不同厂家薄层板进行耐用性考察，在高良姜素薄层鉴别用的配伍溶液色谱图中，与高良姜素对照溶液斑点相应的位置，均显示相同颜色的斑点，且斑点清晰可见，说明该薄层鉴定方法耐用性良好。见图5。

图5 耐用性考察结果Fig 5 Serviceability results

采用不同厂家薄层板进行耐用性考察，在广藿香酮薄层鉴别用的配伍溶液色谱图中，与广藿香酮对照溶液斑点相应的位置，均显示相同颜色的斑点，且斑点清晰可见，说明该薄层鉴定方法耐用性良好。见图6。

图6 耐用性考察结果Fig 6 Serviceability results

高良姜-广藿香配伍溶液的薄层鉴别：综合性价比等考虑，选择青岛海洋化工厂分厂G 硅胶板及GF254 硅胶板。研究表明，与对照品斑点相应的位置，2 种供试品溶液色谱图中均显示相同颜色的斑点。见图7、8。

图7 高良姜素薄层鉴别结果Fig 7 TLC results of galang

图8 广藿香酮薄层鉴别结果Fig 8 TLC results of pogoston

2.2 高良姜-广藿香配伍溶液HPLC 分析方法含量测定项的结果

专属性考察试验：配伍溶液在混合对照品溶液高良姜素和广藿香酮峰的保留时间处有色谱峰，而空白溶液在该保留时间未出现色谱峰，实验结果表明所选溶剂对测定没有干扰，说明本方法专属性强。见图9。

图9 专属性考察结果Fig 9 Specific results

线性关系考察试验：以质量浓度为横坐标（X轴），峰面积积分值为纵坐标（Y 轴）进行线性回归，得到高良姜素、广藿香酮2 种指标性成分的回归方程分别为：y=0.448 x+0.634 8，R²=0.999 0 和y =0.675 x-1.285 2，R² = 0.999 9。结果表明：高良姜素、广藿香酮2 种指标性成分分别在10.00～1 000.00 μg/mL、10.00～640.00 μg/mL 范围内线性关系良好。见图10。

图10 线性关系考察结果Fig 10 Standard curve

精密度考察试验：高良姜素和广藿香酮混合对照品溶液连续6 次进样，测得该2 种指标性成分的峰面积，RSD 分别为0.63%和0.56%，符合要求，结果表明：该研究所建立的方法精密性良好。见表1。

表1 精密度试验结果Tab 1 Precision test results

稳定性考察试验：根据1.3.2 项配制高良姜-广藿香配伍溶液，设置不同时间点进样，检测高良姜-广藿香配伍溶液中高良姜素和广藿香酮2 种指标性成分的峰面积，RSD 分别为1.82%、0.24%，符合要求。结果表明：该研究所建立的检测方法稳定可行。见表2。

表2 高良姜-广藿香配伍溶液稳定性试验结果Tab 2 Stability test results

重复性考察试验：根据1.3.2 项配制高良姜-广藿香配伍溶液6 份分别进样，其中高良姜素、广藿香酮2 种指标性成分的平均浓度分别为283.550 5 μg/mL、67.013 9 μg/mL，RSD 分别为1.30%、0.89%，符合要求。结果表明：该研究所建立的检测方法重复性良好。见表3。

表3 高良姜-广藿香配伍溶液重复性试验结果（μg/mL）Tab 3 Repeatability test results（μg/mL）

加样回收试验：根据1.3.2 项配制高良姜-广藿香配伍溶液9 份，分别加入高良姜素、广藿香酮高、中、低各3 份对照品，测得平均回收率分别为103.19%及100.87%、RSD 分别为0.93%及0.4%，符合要求；结果表明：该研究所建立的检测方法回收率良好，准确可靠。见表4。

表4 高良姜-广藿香配伍溶液回收试验结果（n=9）Tab4 Recovery rate test results（n=9）

用高良姜、广藿香2 种颗粒剂1∶1 配伍，根据1.3.2 项配制高良姜-广藿香溶液10 批，采用以上所建立的HPLC 分析方法，进行其中2 种指标性成分的含量检测。结果表明：高良姜-广藿香配伍溶液中指标性成分高良姜素、广藿香酮含量平均值分别为292.14 μg/mL、76.85 μg/mL，以平均含量的80%为下限，规定高良姜-广藿香配伍溶液中高良姜素的含量应不低于233.71 μg/mL、广藿香酮含量应不低于61.48 μg/mL。见表5。

表5 高良姜-广藿香配伍溶液中指标性成分含量(μg/mL)Tab 5 Sample Content Determination(μg/mL)

3 讨论

该研究就高良姜和广藿香两味中药配伍溶液质量标准进行，为今后对以上两味中药研发产品质量控制奠定基础。按照《中国药典》目前对于中药质量标准的要求，一般选择每味中药一个特征性成分作为薄层鉴别项及含量测定项建立的指标性成分。2020 版《中国药典》中药高良姜质量控制的指标性成分选择高良姜素、中药广藿香质量控制指标性成分选择广藿香醇，但是研究发现高良姜素、广藿香醇两种成分无法实现在一个色谱条件下出现。文献研究表明：广藿香酮也是广藿香中主要活性成分［8］。经过反复实验研究发现广藿香酮可以与高良姜素实现在一个色谱条件下出现。按照质量标准制定科学性可行性的原则，该研究选择高良姜素和广藿香酮两种单体成分作为高良姜和广藿香两味中药配伍溶液质量标准研究的指标性成分合理可行，符合最新版《中国药典》对于中药质量标准的要求。

对于高良姜-广藿香配伍溶液的质量控制，在高良姜素的薄层鉴别项中，通过比较石油醚-乙酸乙酯、环己烷-乙酸乙酯、环己烷-丙酮等不同展开系统发现，展开剂为石油醚-乙酸乙酯（5∶3）时，被测成分（高良姜素）的斑点清晰，与其它成分完全分离。广藿香酮的薄层鉴别项中，通过比较石油醚-乙酸乙酯、环己烷-丙酮、石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸等不同展开系统发现，展开剂为石油醚-乙酸乙酯（5∶1）时，斑点清晰，呈现的结果更佳。在含量测定方法的建立过程中，通过全波长扫描，显示310 nm 波长下2个色谱峰峰形最好，故选择 310 nm 为检测波长；在样品制备中，分别考察了乙醇、乙酸乙酯、甲醇为溶剂时样品中高良姜素、广藿香酮2 种指标性成分的含量，结果显示，以甲醇为溶剂时2 种成分色谱峰峰面积最高；分别考察了0.1% 磷酸水溶液-甲醇、0.2%磷酸水溶液-甲醇、0.2 磷酸水溶液-乙腈3 种流动项系统的影响，结果以0.2%磷酸水溶液-甲醇为流动相时，高良姜素、广藿香酮2 个指标性成分色谱峰峰型及分离度良好，均符合要求。

本研究在进行专属性、稳定性及耐用性考察符合要求的的基础上，建立了高良姜-广藿香配伍溶液的薄层色谱鉴别项；同时，对高良姜-广藿香配伍溶液中高良姜素、广藿香酮2 种指标性成分分析高效液相色谱法进行专属性、精密度、稳定性、重复度以及回收率进行考察，在符合要求的基础上建立了该配伍溶液的高效液相色谱法含量测定项。综上，已建立的高良姜-广藿香配伍溶液质量标准的研究方法，可用于高良姜-广藿香配伍溶液的质量控制，本研究为今后该两味特色南药健康产品及新药研发、中西医结合临床治疗疾病奠定科学基础。

作者贡献度说明：

李庄琦：补充薄层色谱图，处理数据，对论文进行修改；薛千蓉：设计实验方案、负责薄层色谱实验以及论文起草；练秀霞：负责含量测定方法学验证并对数据进行分析；文欢、邝杨君：负责实验材料的购买和处理薄层色谱图；张俊清：提供研究经费、实验仪器及场地；王舒婷，李海龙：指导实验、指导论文攥写及修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。