年龄相关性黄斑变性的研究进展

魏丹丹，宋宇涵，王 淇，宿树兰，朱 悦，段金廒

南京中医药大学 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023

目前中国人口结构已进入老年型,深入研究衰老及老年相关疾病、科学应对人口老龄化是新时代的国家重大需求。在众多老年相关疾病中,年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)严重威胁着老年人群的视力健康。

1 AMD简介

AMD为视网膜黄斑区域的退行性疾病,引起进行性中央视力丧失,是65岁及以上老年人视力丧失甚至失明的主要原因。流行病学研究表明,中国发达城市AMD发病率高达15.5%,预计2040年全球患者将达到2.88亿人。临床上以玻璃疣大小将AMD分为早期、中期、晚期3个阶段,晚期AMD导致严重的永久性中央视力丧失,晚期AMD包括干性或湿性两种类型。干性AMD目前尚无有效的治疗手段,湿性AMD主流疗法为玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗体。

2 AMD发生、发展的新近研究进展

AMD病变主要包括视网膜色素上皮细胞(recular pigment endothelial, RPE)以及感光层的丧失、RPE下方脂质和蛋白质积累或Bruch膜中蛋白质沉积、绒毛膜毛细血管脱落、脉络膜新生血管和盘状瘢痕以及小胶质细胞、巨噬细胞募集以及补体激活引起的炎性反应。迄今为止AMD机制尚不完全清楚,但视网膜在老化和压力刺激下导致的一系列内稳态失衡在其发生、发展中起重要作用[1]。

2.1 细胞衰老-更新失衡

视网膜细胞更新和修复的能力差,使其罹患退行性疾病风险大大增加。RPE具有维持视网膜内稳态功能,随着年龄增长细胞反复复制导致端粒变短,RPE等体细胞分裂能力下降引发复制性细胞衰老。RPE细胞衰老是AMD的关键环节,表现为衰老相关-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)上调、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)增多等。衰老的RPE细胞溶酶体消化能力下降导致细胞内蛋白聚集体和脂褐素等代谢废物堆积,脂褐素的积累导致早期AMD的发生,脂褐素在光暴露下产生自由基导致RPE细胞溶酶体功能障碍,吞噬功能进一步受损促进AMD发展[2]。衰老RPE细胞的DNA损伤促进细胞内脂褐素的堆积,SA-β-gal可以抑制线粒体分裂进一步促进脂褐素生成。

紫外线辐射、香烟暴露、氧化应激等可作为应激源,作用于细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)抑制剂以及p53下游信号,阻止下游低磷酸化的视网膜母细胞瘤基因(retinoblastomal, Rb)蛋白磷酸化,抑制S期DNA复制减慢细胞周期,触发压力引起RPE等细胞早衰。贝伐单抗显著降低CDK2、CDK4和CDK6以及cyclin D和E的表达,阻断RPE细胞的G1/S进展[3]。多柔比星等药物暴露也能够导致RPE细胞衰老,与胚胎干细胞共孵育可通过TGF-β和PI3K信号通路逆转早衰的RPE细胞[4-5]。衰老的RPE细胞破坏了血-视网膜屏障,导致RPE吞噬光感受器外节能力和调节类视黄醇循环能力下降,RPE代谢效率低下、识别和去除受损蛋白质的泛素蛋白酶体和自噬溶酶体系统功能受损,导致细胞内泛素化蛋白质堆积和视网膜细胞外沉积物聚集,形成了包含脂质、脂蛋白、脂褐素、β-淀粉样蛋白以及炎性相关因子多种有害物质的玻璃膜疣并充当抗原刺激,激活免疫系统。年龄相关的Bruch膜细胞外基质胶原纤维交联度增加,导致载脂蛋白等大分子在通过视网膜时受阻沉积,进而导致视网膜色素上皮和感光层损伤。

2.2 氧化压力-抗氧化失衡

线粒体的脂肪酸β氧化为RPE细胞提供大量能量,与此同时产生大量的自由基,视网膜高含量的脂质增加了RPE氧化应激的风险,RPE细胞主要抗氧化机制为核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)。衰老的RPE中Nrf2的转录和表达量下降甚至沉默,导致其无法有效地与细胞质中的Kelch样ECH相关蛋白1分离活化并进入细胞核,与抗氧化反应元件结合,导致下游超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽还原酶、硫氧还原酶等抗氧化剂短缺。低度ROS可活化氧化信号以维持生理功能,但慢性香烟烟雾、光暴露等刺激造成RPE细胞内ROS堆积,造成多不饱和脂肪酸等脂质过氧化,导致视网膜铁蓄积[6-7]。RPE细胞内过量的铁通过GSH-GPx-4和FSP1-CoQ(10)-NADH信号转导导致RPE细胞铁死亡并加速视网膜的老化,依赖于RPE提供营养和清除代谢废物的光感受器细胞随之死亡[8]。RPE细胞功能障碍和丢失触发早期AMD的发生及进展,最终导致视网膜变性,二十二碳六烯酸对铁超载小鼠模型的氧化应激和干性AMD具有保护作用[9-10]。

脂质过氧化产物可以氧化修饰视网膜细胞内的DNA、蛋白质、脂质、线粒体DNA等大分子使其转变为寿命更长的氧化应激刺激物--氧化特异性表位(oxidation-specific epitopes, OSEs),如晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs),AGEs促进其他OSEs的保留并防止其被模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)清除。OSEs通过与PRRs相互作用招募小胶质细胞,下调26S蛋白酶导致细胞内泛素化蛋白质蓄积促进脂褐素和玻璃膜疣的形成,并产生神经毒性炎性介质,清除濒死神经元,破坏并吞噬光感受器。受损的线粒体DNA正反馈地促进细胞内ROS进一步增加并加剧线粒体功能失调,氧化损伤的DNA分子导致视网膜细胞DNA甲基化、端粒变短、组蛋白脱乙酰化、线粒体功能失调、转录组变化等功能异常。给予外源性线粒体来源的24肽护脑素HG可以降低细胞内炎性指标的蛋白水平,如CD62E/E-Selectin、CD62P/P-Selectin、ICAM-1、TNF-α、MIP-1α、IFN-γ、IL-1β、IL-13、IL-17A等,减轻线粒体DNA介导的炎性反应[11]。RPE中特异性地过表达Nrf2可以保护RPE形态和功能并防止感光细胞层被破坏[1]。巨噬细胞NAD+消耗酶的过度表达导致视网膜微环境中NAD+浓度下降,触发巨噬细胞炎性途径激活、炎性细胞正反馈聚集和ROS积累[12]。给予其前体如烟酰胺核糖NR和烟酰胺单核苷酸NMN可通过Sirt3-Nrf2等通路恢复氧化-还原平衡改善AMD[13-14]。

2.3 慢性炎性反应-抗炎失衡

视网膜中的硬脂酸通过Toll样受体4(toll-like receptor 4, TLR4)重塑染色质,选择性地增强AP-1结合位点并触发先天免疫系统持续重编程。视网膜中的AGEs可以放大炎性反应,保留炎性碎片或细胞残留物形成玻璃膜疣,触发AMD。氧化压力和线粒体功能失调可活化炎性小体NLRP3和cGAS/STING,激活NF-κF转录因子,释放IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等,导致视网膜长期处于慢性低度炎性环境,加剧AMD的进展。衰老相关分泌表型SASPs包括促炎细胞因子IL-6、IL-8、CXCL1、CXCL2、CSF-1,一方面诱导周围健康细胞发生细胞衰老,另一方面以自分泌、旁分泌的方式诱导免疫细胞聚集,引起慢性炎性反应。衰老的RPE细胞内蓄积的ROS可以激活NLRP3炎性小体和NF-κF信号通路,上调caspase-1,促进IL-1β、IL-18等炎性因子的前体转化为活性形式,并激活其他炎性因子,随着炎性反应的加剧免疫功能下降。NLRP3在AMD发展过程中的作用,目前尚存在争议,有研究认为在AMD的后期抑制NLRP3相关信号可防止RPE变性和干性AMD的进展,另一些研究则认为NLRP3信号可防止AMD进一步发展。此外,衰老的RPE招募小胶质细胞,激活补体系统并释放玻连蛋白和簇蛋白等补体通路调控因子,形成C3和C5膜攻击复合物等促炎反应物,导致细胞溶解和释放趋化因子,进一步介导炎性细胞包括小胶质细胞和巨噬细胞募集,视网膜单核吞噬细胞的免疫状态是AMD进展、转归的关键决定因素[15]。

2.4 自噬功能失衡

自噬为RPE及视网膜代谢提供了至关重要的支持,保护视网膜免受压力和生理衰老的影响。早期AMD患者中央凹周围RPE中PTEN诱导激酶1(PTEN induced kinase 1, PINK1)降低,PINK1缺陷型RPE线粒体自噬和线粒体功能受损,触发上皮-间充质转化,这种作用可以被一种分泌性蛋白Kallistatin所逆转[16-17]。当自溶体形成受损时分泌性自噬取代退化性自噬,导致RPE释放蛋白质-蛋白质聚集体、脂褐素、β-淀粉样蛋白、线粒体缺陷、促炎因子和促血管生成因子,形成玻璃膜疣和脉络膜新生血管。抑制分泌性自噬可能是AMD的一种治疗策略,分泌性自噬体特异性的TRIM16、SEC22B和RAB8A蛋白可能是治疗靶点的主要候选蛋白[18]。年龄的增长导致褪黑素含量下降,补充褪黑素通过抑制低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)/Bcl2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3, BNIP3)-轻链3B(light chain 3B, LC3B)/线粒体自噬信号抑制碘酸钠诱导的ARPE-19细胞凋亡[19]。

2.5 肠道屏障和肠道微生态失衡

随着衰老的进展,由上皮细胞、黏液层、抗菌肽、IgA分泌的免疫球蛋白构成的肠道上皮屏障功能下降,导致肠道微生物的多样性和丰富性下降。肠道微生物的结构也随着衰老逐渐变化:水解蛋白质的潜在的肠道病原菌丰度增加,有利于维持肠道屏障功能完整性的水解糖类的肠道菌以及具有抗氧化活性的肠道菌丰度下降[20-21]。肠道菌及其代谢产物如短链脂肪酸可以直接或者间接修饰不同细胞的表观基因组,从而调节免疫细胞功能,老化的肠道菌群及其代谢产物可以刺激免疫系统的先天免疫应答和适应性免疫应答,诱导全身性炎性反应,通过“肠-眼轴”、“肠-视网膜轴”在视网膜远端影响免疫状态,导致视网膜长期处于炎性环境,诱发AMD的发生和发展。老化的肠道内乳酸菌丰度下降,乳酸可缓解线粒体膜电位破坏、减轻细胞内ROS,上调LC3II/I的比例激活自噬、增加LC3点状和自噬液泡的形成,保护线粒体功能并防止氧化应激诱导的视网膜变性[22]。

2.6 促血管生成-抗血管生成失衡

RPE同时生成促血管生成因子VEGF以及抗血管生成因子--色素上皮衍生因子维持正常视网膜内稳态;衰老或早衰的RPE细胞内蓄积的ROS通过低氧诱导因子HIF-1α通路上调VEGF的表达,促进脉络膜新生血管形成。脆弱的脉络膜新生血管易破裂受损,促使邻近RPE缺氧并上调VEGF表达,导致绒毛膜、毛细血管血流失调,加剧湿性AMD进展[23]。

3 问题与展望

AMD的发病机制尚不完全清楚、缺乏特异性专属性衰老相关靶点,严重阻碍了AMD药物研发进程。NF-κF、Nrf2、VEGF是其主要靶点,NF-κF抑制剂、Nrf2激活剂、VEGF抗体、补体抑制剂、端粒激活剂、细胞周期调节剂、微生态调节剂可以在一定程度上促使受损的视网膜重获细胞内稳态,可以在一定程度上延缓AMD的发生和发展。