决明子饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的关联研究

梁彩娟 李思远 高 晗 李雪利 田 方 李军山，2，3*

1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.云南省配方颗粒重点实验室，云南 楚雄 675000；3.云南神威施普瑞药业有限公司，云南 楚雄 675000

决明子为豆科植物钝叶决明CassiaobtusifoliaL.或决明(小决明)CassiatoraL.的干燥成熟种子。决明子用药历史悠久，其既可食用，也可作药用，是卫健委公布的110种药食同源的品种之一[1]。本品味甘、苦、咸，性微寒。入肝、大肠经。具有清热明目，润肠通便的功效[2]。决明子含有蒽醌类、萘并吡喃酮类、多糖类、氨基酸类等多种化学成分，具有降压调脂、抗氧化、保护肝脏、抑菌等作用[3-7]。

决明子为典型的清热泻火药，因其在中医临床中用药广泛，需求量大，目前已被加工成多种剂型，如决明子粉，决明子配方颗粒等。决明子配方颗粒由决明子饮片经提取、浓缩、干燥、制粒等工序制成，具有携带方便，易冲服，质量稳定均一等优势。2021年国家药典委员会发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，文中提出将“标准汤剂”作为衡量单位中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的物质基准，并说明从原料到中间体到配方颗粒生产全过程的特征图谱应具有相关性[8]。此外，由于配方颗粒失去了饮片的性状、气味及显微特性，难以进行直观的真伪鉴别，因此需建立专属性强、重复性好且稳定的检测方法来控制决明子配方颗粒的质量。目前有利用特征图谱及多组分含量测定的方法控制决明子药材质量的相关报道[9-18]，但并无决明子饮片-标准汤剂-配方颗粒的相关性研究，全面控制决明子配方颗粒质量的研究也较少。特征图谱是一种从整体上控制中药质量的方法，能很好地体现配方颗粒中化学成分的分布情况。本研究采用HPLC法建立了决明子饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱，并以特征峰为分析对象进行相似度分析。决明子饮片、标准汤剂、配方颗粒之间主要成分的相关性评价，能准确地反映饮片、标准汤剂和配方颗粒之间主要化学成分的可追溯性，为决明子配方颗粒生产全过程质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪，CPA225D型电子天平(赛多利斯公司)，R502B旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)，DK-98-IIA电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，shunliu-12N冷冻干燥机(南京顺流仪器有限公司)。乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

1.2 对照品 决明子(钝叶决明)配方颗粒由神威药业集团有限公司提供。橙黄决明素(批号：111900-202006)，大黄素(批号：110756-201913)，芦荟大黄素(批号：110795-202011)，大黄酚(批号：110796-201922)，均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 药材、标准汤剂与配方颗粒

1.3.1 药材 15批决明子药材购自浙江、四川、安徽3个产区，经原河北省药品检验所孙宝惠老师鉴定均为钝叶决明CassiaobtusifoliaL.的干燥成熟种子。15批药材的产地信息见表1。

表1 15批药材产地信息

1.3.2 标准汤剂 根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》及《医疗机构中药煎药室管理规范》中相关规定，确定决明子标准汤剂制备工艺为：取决明子饮片100 g，加水煎煮两次，一煎加8倍水，浸泡30 min，煎煮30 min，过200目筛，立即冷却至室温；二煎加6倍水，煎煮 20 min，过200目筛，立即冷却至室温，合并2次煎液，低温浓缩至密度为1.02～1.08(65 ℃)，冷冻干燥，即得。

1.3.3 配方颗粒 依据标准汤剂出膏率、特征图谱、含量等参数要求进行工艺优化，确定决明子配方颗粒制备工艺为取决明子饮片200 g，加水提取两次，第一次加饮片量8倍水，煎煮1 h，200目筛滤过，第二次加饮片量6倍水，煎煮30 min，200目筛滤过。80 ℃以下真空浓缩至相对密度为1.03～1.07(65 ℃)的浓缩液，过300目筛，喷雾干燥。膏粉加辅料适量，混匀，干法制粒，制成决明子配方颗粒。

2 方法与结果

2.1 决明子饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱建立

2.1.1 色谱条件 Agilent TC C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，0～10 min 17%A→28%A，10～15 min 28%A→34%A，15～25 min 34%A→55%A，25～30 min 55%A→80%A，30～35 min 80%A；流速：1.0 mL/min；检测波长：290 nm；进样量：10 μL。理论板数按橙黄决明素峰计算应不低于5000。

2.1.2 对照品溶液的制备 取橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL含橙黄决明素100 μg、芦荟大黄素 20 μg、大黄素40 μg和大黄酚10 μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

2.1.3.1 决明子饮片供试品溶液制备 取本品粉末(过四号筛)约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声处理 30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为饮片供试品溶液。

2.1.3.2 标准汤剂、配方颗粒供试品溶液制备 取本品粉末约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为标准汤剂供试品溶液。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度 取同一批决明子标准汤剂，按2.1.3.2项下供试品制备方法处理，按2.1.1项下连续进样6次，以橙黄决明素峰为参照物，经计算特征峰相对保留时间的RSD为0.00%～0.11%，相对峰面积的RSD为0.00%～1.02%，表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性 取同一批决明子标准汤剂6份，按2.1.3.2项下进行处理，按2.1.1项下测定。以橙黄决明素峰为参照物，经计算特征峰相对保留时间的RSD为0.00%～0.13%之间，相对峰面积的RSD为0.00%～1.07%，表明该方法重复性良好。

2.2.3 稳定性 取同一批决明子标准汤剂按2.1.3.2项下进行处理，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h按2.1.1项下进样测定。以橙黄决明素峰为参照物，经计算特征峰相对保留时间的RSD为0.00%～0.14%，相对峰面积的RSD为0.00%～0.86%，表明样品在12 h内稳定。

2.3 样品测定 取15批决明子饮片、决明子标准汤剂、决明子配方颗粒，按2.1.1项下进样检测，色谱图如图1～3所示。

图1 决明子饮片特征图谱

图2 决明子标准汤剂特征图谱

图3 决明子配方颗粒特征图谱

2.4 特征峰指认 通过比较供试品与对照品的保留时间并对色谱峰进行标定，确认了4个特征峰，分别为橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚。如图4所示。

R：决明子标准汤剂对照特征图谱；S：混合对照品；峰3：橙黄决明素；峰4：芦荟大黄素；峰6：大黄素；峰7：大黄酚

2.5 相似性分析 将决明子饮片、标准汤剂、配方颗粒对照图谱进行比较，如图5所示。并导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)计算相似度，见表2。结果表明7个特征成分在决明子饮片→标汤→颗粒的制备过程中得到保留。通过计算，决明子饮片、标准汤剂、配方颗粒对照图谱相似度在0.90～1.00之间，表明决明子饮片、标准汤剂、配方颗粒有较好的相似性。

图5 决明子饮片(S3)、标准汤剂(S2)和配方颗粒(S1)对照图谱比较图

表2 决明子饮片、标准汤剂、配方颗粒对照图谱相似度计算结果

3 讨论

3.1 流动相的选择 本研究以乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.3%乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱，发现采用乙腈-0.1%乙酸溶液进行洗脱时，特征峰的峰形及分离度均较好。尝试甲醇和乙腈，发现乙腈洗脱能力更强，特征图谱中特征峰的分布及峰形更好，最终选择乙腈-0.1%乙酸溶液为流动相。

3.2 波长选择 经全波长扫描发现，样品中特征峰在290 nm处均有较大吸收，各色谱峰响应及分离度均较好，能反映出决明子中的主要成分，因此选择290 nm为检测波长。

3.3 供试品制备方法考察 通过比较水、30%、50%、70%甲醇等不同提取溶剂，发现采用70%甲醇超声处理，图谱中特征峰数量较多，响应值均较高。超声与回流提取方式考察，发现超声与回流效果无太大差别，因此选择操作简单的超声提取法。

通过相似性研究发现决明子配方颗粒与饮片、标准汤剂特征图谱相似性高，化学成分基本一致，能准确的反映饮片、标准汤剂和配方颗粒之间主要化学成分的可追溯性，为决明子配方颗粒生产过程的质量控制提供参考依据。