基于网络药理学、分子对接和实验验证探讨苹果对溶血致高胆红素血症的影响

安 琼，魏 媛，李 倩，王江文，岳国仁，王贞香

（河西学院医学院，甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000）

新生儿高胆红素血症又称新生儿黄疸，是新生儿常见的临床问题，我国高胆红素血症新生儿的发病率为50%～80%，该病由于胆红素（主要指间接胆红素（indirect bilirubin，IB））代谢异常，引起血中胆红素水平升高，出现以皮肤、黏膜及巩膜黄染为特征的症状。新生儿黄疸早期症状不明显，后期出现典型的神经功能异常，并留有后遗症。因此尽早预测胆红素对神经组织的损伤有助于临床预防胆红素脑病的发生，对降低新生儿病死率及致残率具有重要的意义[1-4]。

新生儿体内胆红素代谢主要经肝脏代谢，而新生儿肝功能发育不完善，造成肝细胞摄取胆红素的能力低下；并且新生儿酶系统不成熟，其中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶含量低且活力不足，不能有效地将IB与葡萄糖醛酸结合形成直接胆红素（结合胆红素）；新生儿胆红素产生过多或其他阴离子含量增加都会引起胆红素排泄发生障得，尤其是早产儿，会暂时出现肝内胆汁淤积[5]。目前，对新生儿黄疸的治疗主要是通过药物治疗、照射治疗、换血治疗等方法[6]。这些方法对新生儿黄疸有一定的疗效，但对机体有一定的影响[7-8]。因此有必要探究治疗新生儿黄疸的新方法。

苹果是蔷薇科落叶乔木的果实，原产于欧洲及亚洲中部，在我国辽宁、河北、甘肃、四川和西藏等地常见栽培[9]，广受人们喜爱。在我国《名医别录》中记载，苹果果实入药[10]，其作为一种药食两用水果，具有较高的营养价值和经济价值。苹果中含有大量的黄酮类、酚酸类和三萜类等生物活性物质。黄酮类主要有黄酮类、黄酮醇类、黄烷醇类、花色苷类、查耳酮类等。目前，已从苹果中发现黄酮类35 种，如儿茶素、表儿茶素、槲皮素等；酚酸类21 种，如对香豆酰奎尼酸、奎尼酸、绿原酸、咖啡酸等；三萜类24 种，如熊果酸、β-谷甾醇等。这些生物活性成分使苹果具有多种药理活性，但是对于苹果是否对胆红素的代谢有影响鲜见报道。

网络药理学是系统生物学的重要组成部分，它可预测中药活性成分和其作用机制，构建“药物-成分-靶点-疾病”的作用网络，为疾病作用机制的研究、新药的研发奠定基础[11]。因此，本研究采用中药复方的网络药理学研究方法，预测苹果活性成分与高胆红素血症的网络关系，探究苹果活性成分的作用靶点与高胆红素血症患者内源性蛋白和信号通路之间的作用关系。并用分子对接验证网络分析的可靠性，然后用制备的苹果醇提取物干预溶血性黄疸大鼠模型，测定总胆红素（total bilirubin，TB）、IB等相关指标，探究苹果对溶血致高胆红素血症代谢的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SD（SPF级）雄性大鼠60 只，体质量180～220 g。每笼3～4 只，饲养在室温（24±1）℃，普通饲料喂养，自由饮水，适应性饲养7 d。实验过程遵循《关于善待实验动物的指导性意见》。所有动物研究均按照天津市实验动物使用和护理委员会制定的指南进行，整个项目方案由南开大学动物伦理委员会批准。动物使用许可证号：SYXK（津）2019-0003。

成熟的鲜苹果品种为市售静宁红富士。

茵栀黄口服液（10 mL/支，含黄芩苷0.4 g）北京华润高科天然药物有限公司；盐酸苯肼 上海麦克林生物科技有限公司；氯化钠注射液 华润双鹤药业股份有限公司；75%医用酒精 德州绿海医疗科技有限公司；碘伏消毒液 兰州美尔康生物科技有限公司；甲醛 天津市百世化工有限公司；伊红染液、苏木精 珠海贝索生物技术有限公司；无水乙醇天津致远化学试剂有限公司；槲皮素对照品、没食子酸对照品、表儿茶素对照品、根皮素对照品、β-谷甾醇对照品、白细胞介素-6酶联免疫吸附测试（interleukin-6 enzyme-linked immunosorbent assay，IL-6 ELISA）试剂盒、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒 上海优选生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

一次性使用负压采血容器 山东省成武县医用制品厂；H12型血红蛋白（hemoglobin，HB）分析仪 桂林优利特医疗电子有限公司；BCD-610普通冰箱 美的集团；半自动石蜡切片机、组织脱水处理机、自动组织包埋机 德国SLEE公司；微量移液器 德国Sartorius公司；802B离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司；高温高压灭菌锅日本SANYO公司；干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；1681130酶标仪 美国Bio-Rad公司；7600S全自动生化分析仪 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 苹果活性成分与靶点的筛选

通过CNKI、PubMed查阅文献资料搜集苹果的活性组分，在本草组鉴、ECTM、Swiss ADME数据库（http://www.swissadme.ch/）中输入相关化合物的Canonical SMILES，选取胃肠吸收度高、类药性优的化合物作为目标化合物，然后在Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch./）中输入目标化合物的Canonical SMILES号，选择物种为“Homo Sapiens”，筛选其中probability＞0.7的靶点为苹果活性成分的目标靶点[12]。

1.3.2 溶血所致高胆红素血症靶点的筛选

以“Hyperbilirubinemia”“Hemolytic jaundice”为检索词，分别从GeneCards、Drugbank、Therapeutic Target Database、OMIM等疾病数据库中获得治疗溶血所致高胆红素血症的作用靶点。

1.3.3 苹果活性成分与溶血所致高胆红素血症网络的构建

用Venny2.1.0在线软件寻找苹果活性成分靶点和疾病靶点的共同作用靶点，并绘制苹果活性成分靶点与疾病相关靶点的Venn图；将获得的共同作用靶点导入STRING数据库，检索筛选并且分析获得的蛋白质相互作用网络，然后用Cytoscape 3.9.1软件分析获得网络图中的关键靶点。

1.3.4 核心靶点的基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

将1.3.3节中获得的苹果活性成分和疾病的共同作用靶点导入Metascape数据库，对其进行GO和KEGG的富集分析。用Cytoscape 3.9.1软件构建苹果的“疾病-通路-活性成分-靶标”网络，分析潜在靶标的相互作用。

1.3.5 分子对接验证

根据苹果的“疾病-通路-活性成分-靶标”网络分析结果及潜在靶标相互作用，分别筛选网络中度值靠前的活性成分和重要的潜在靶标进行分子对接。通过PubChem网站（http://zinc.docking.org/）获取小分子的2D结构，利用ChemBio3D软件将其转化为mol2文件备用；在PDB数据库（https://www.rcsb.org/）查询并获取靶标的3D结构，用PyMOL软件取小分子、加氢后保存备用。将小分子和靶蛋白数据导入Autodock软件进行分子对接，获得对接结合能、氢键等信息，以此评价活性成分和潜在靶标相互结合的稳定性和网络药理分析结果的可靠性。

1.3.6 验证实验

1.3.6.1 苹果醇提取物（apple alcohol extract，AE）的制备

称取适量苹果放入榨汁机中打碎，用体积分数75%乙醇溶液按液料比1∶1（mL/g）回流提取1.5 h，提取2 次，合并滤液补足质量，用0.20 μm的滤膜过滤，采用标准对照法，用高效液相色谱进样分析。采用Intersil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。没食子酸、表儿茶素、根皮素、槲皮素的分析采用程序1：检测波长280 nm，柱温30 ℃，流动相A为甲醇，流动相B为体积分数0.1%的磷酸溶液，梯度洗脱：0～10 min，5%～10%A，95%～90% B；10～13 min，10%～67% A，90%～33% B；13～20 min，67%～61%A，3 3%～3 9% B；20～40 min，61%～55% A，39%～45% B。β-谷甾醇采用程序2：检测波长210 nm，柱温30 ℃，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（体积比为98∶2），等度洗脱。进行动物实验时，按制备方法同比例增加液料比，对获得的提取液浓缩至所需浓度。

1.3.6.2 造模、分组与给药

取SD雄性大鼠60 只，随机分为6 组：空白组、模型组、阳性对照组（茵栀黄注射液）、AE低剂量干预组、中剂量干预组、高剂量干预组，每组10 只。参考杨李等[13]的方法，连续两天以腹腔注射盐酸苯肼建立溶血性高胆红素血症大鼠模型，初次注射量为50 mg/kgmb，第2次注射剂量减半，每天一次；在末次注射24 h后进行干预。阳性对照组给予茵栀黄注射液1.2 mL/kgmb，AE低剂量组40 g/kgmb，AE中剂量组80 g/kgmb，AE高剂量组160 g/kgmb，空白组和模型组给予等体积的生理盐水，每天一次，在干预过程中，取大鼠尾尖血，用HB仪测定HB水平。干预3 d后，腹腔注射5%水合氯醛进行麻醉，心脏采血，用重氮试剂法测定TB和IB水平，用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）水平，用试剂盒测定TNF-α、IL-6水平。切取肝左叶相同部位肝组织约2 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，在10%福尔马林溶液中浸泡24 h，用小流水冲洗24 h，待组织固定完全后（没有红色或淡红色的组织），取出用于苏木精-伊红染色[14]。

1.4 数据处理与分析

实验获得的数据结果应用SPSS26.0统计软件处理，结果以±s表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 苹果的活性成分

根据1.3.1节搜集整理苹果成分的方法，获得化学成分共44 个。根据数据库的筛选符合胃肠吸收度高、类药性优的化合物，确定17 个成分为苹果的主要活性成分，具体信息见表1。

表1 苹果的主要活性成分Table 1 Major active components of apples

2.2 苹果活性成分潜在的靶标

通过Swiss Target Prediction数据库查询17 个化合物的成分靶标，整理获得288 个苹果醇提物的成分靶标。将苹果活性成分的靶标与疾病靶标通过Venny 2.1.0在线软件取交集，获得苹果活性成分治疗溶血性高胆红素血症的潜在靶标81 个，如图1所示。

图1 苹果活性成分靶标与溶血所致高胆红素血症疾病靶标交集后的Venn图Fig.1 Venn diagram of the intersection between the targets of active ingredients in apples and those of hemolysis-induced hyperbilirubinemia

2.3 苹果活性成分治疗溶血所致高胆红素血症的关键靶点网络图

将2.2节获得的潜在靶标输入STRING数据库，选择“Multiple protein”“Homo sapiens”，设置置信水平为0.700，隐藏没有关联的节点，涉及122 个节点，其中靶标丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、酪氨酸激酶（tyrosine kinase，SRC）、信号传导及转录激活因子3（signal transducer andactivator of transcription 3，STAT3）、热休克蛋白90A1（heat shock protein 90A1，HSP90A1）、早期原癌基因JUN、缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1A）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）在网络中节点最大，颜色最深（图2），可能与苹果治疗溶血所致高胆红素血症密切相关。

图2 治疗溶血所致高胆红素血症潜在靶标相互作用网络Fig.2 Network of potential target interaction for the treatment of hemolysis-induced hyperbilirubinemia

2.4 苹果活性成分潜在靶标KEGG与GO富集结果

将81 个潜在靶点通过Metascape数据库进行KEGG分析，获得81 条信号通路，-lgP越大则表明富集的程度越高[15]。取KEGG分析的前20具体信号通路信息，结果见图3。苹果活性成分治疗溶血所致高胆红素血症潜在靶点主要富集在胆汁分泌、HIF-1信号通路、TNF信号通路、核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路等相关通路。

图3 苹果治疗高胆红素血症潜在靶标的KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of potential targets of apples for the treatment of hyperbilirubinemia

由图4可知，苹果活性成分与溶血所致高胆红素血症潜在靶点主要分布于细胞前沿、细胞质核周区域、细胞外膜等细胞组分中；苹果的活性成分可能通过与蛋白质结合，激活跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、磷酸转移酶活性，与泛素-类蛋白连接酶结合等方式，参与细胞迁移正向运动、细胞运动的正向调控、血管内皮生长因子受体信号通路、上皮细胞增殖调控、血管生成等生物过程，从而发挥苹果活性成分治疗溶血所致高胆红素血症的作用。

图4 苹果治疗高胆红素血症潜在靶标的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets of apples for the treatment of hyperbilirubinemia

2.5 苹果“疾病-通路-活性成分-靶标”网络图的构建结果

苹果的“疾病-通路-活性成分-靶标”网络关联结果如图5所示，图中红色三角形代表药物，深蓝色四边形代表疾病，绿色椭圆形代表活性成分，紫色六边形代表通路，粉色正方形代表靶点。根据网络分析中度值标识节点的大小评估贡献，节点越大，所起的贡献越大。在苹果的17 个活性成分中，其中PG4（槲皮素：101）、PG11（2α-羟基熊果酸：74）、PG12（β-谷甾醇：56）、PG3（根皮素：47）、PG2（表儿茶素：45）在治疗溶血所致高胆红素血症中起重要的作用。

图5 苹果的“疾病-通路-活性成分-靶标”网络关联Fig.5 Disease-pathway-active component-target network for apples

2.6 分子对接结果

在2.5节构建的网络中，网络中度值筛选排名前5的活性成分（槲皮素、2α-羟基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表儿茶素）分别与网络中较为重要的潜在靶标（AKT1、VEGFA、EGFR、STAT3、SRC）进行分子对接，通过分子对接可以验证上述网络药理分析结果的可靠性。结合能小于-1.2 kcal/mol，表示活性成分和靶标结合良好；结合能大于-4.0 kcal/mol时，表示活性成分和靶标有较强的结合能力[16]。从表2可以看出，苹果筛选的活性成分和获得的治疗溶血所致高胆红素血症潜在靶标有较强的亲和能力，选择这5 种活性成分与潜在靶标分子结合最稳定的对接结果绘制分子对接图（图6）。

图6 苹果活性成分与潜在靶标分子部分对接Fig.6 Molecule docking diagrams of active components in apples with potential targets

表2 苹果活性成分与潜在靶标分子对接结果Table 2 Molecules docking results of potential targets with active components of apples

2.7 AE成分分析

根据1.3.6.1节的方法及条件对样品溶液和对照品溶液进行分析，没食子酸、表儿茶素、根皮素、槲皮素、β-谷甾醇能得到较好的分离，结果如图7所示。

图7 对照品色谱图Fig.7 Chromatogram of references

2.8 AE干预溶血所致高胆红素血症大鼠的实验结果

如图8所示，空白组大鼠生长状态良好、毛色有光泽、尾部红润，尿液略显浅黄色；模型组大鼠反应迟钝、尾部成灰黄色、毛色晦暗、眼睛灰黄，尿液呈深黄色。

图8 造模后与造模前实验动物比较Fig.8 Comparison of normal and hyperbilirubinemic rats

如表3所示，与空白组比较，模型组的HB水平均明显降低（P＜0.01），TB、IB、ALT、AST水平均明显增高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组、AE高剂量组、AE中剂量组、AE低剂量组的HB水平均升高（P＜0.05），TB、IB、ALT、AST水平均显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。肝脏组织染色结果见图9。

图9 肝脏组织病理切片结果Fig.9 Pathological sections of liver tissues

表3 大鼠血液中HB、TB、IB、ALT、AST的指标（n＝12）Table 3 Levels of HB,TB,IB,ALT and AST in the serum of rats (n=12)

如表4所示，与空白组比较，模型组的血液TNF-α、IL-6质量浓度极显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性对照组、AE高剂量组、AE中剂量组、AE低剂量组的TNF-α、IL-6水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 大鼠血液中的指标TNF-α、IL-6水平（n＝12）Table 4 Levels of TNF-α and IL-6 in the serum of rats (n=12)

3 讨论与结论

有研究表明，苹果多酚可通过清除自由基抑制脂质过氧化反应，提高机体抗氧化能力，促进肝细胞修复与再生，从而起到保肝利胆的作用[17-18]。通过网络药理学的分析，筛选出17 个符合胃肠吸收度高、类药性优的苹果活性成分。其中槲皮素、2α-羟基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表儿茶素在治疗溶血所致高胆红素血症起重要的作用。研究发现β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、调节免疫系统、抗衰老等生物活性[19]，从而能够发挥抗溶血性黄疸的作用；槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗衰老、提高免疫力、抗肝病等作用[20]，故有助于溶血性黄疸的治疗；表儿茶素具有抗炎、抗氧化、保护神经、预防非酒精性脂肪肝和抗肝纤维化[21]，从而发挥抗溶血性黄疸的作用。

溶血所致高胆红素血症与苹果活性成分的交集靶点有81 个，中度值排名前5的关键靶点为AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3。AKT1参与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol kinase 3，PI3K）、EGFR等多个通路，在炎症、细胞增殖、迁移和纤维形成的肝损伤过程中起着独特的作用[22]。VEGFA的表达可以促进血管形成，在肝脏的再生和修复过程中起重要作用[23]。

GO的富集分析预测苹果的活性成分可能通过与蛋白质结合，激活跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、磷酸转移酶活性，与泛素-类蛋白连接酶结合等方式，参与细胞迁移正向调控、细胞运动的正向调控、血管内皮生长因子受体信号通路、上皮细胞增殖调控、血管生成等生物过程，从而发挥苹果活性成分治疗溶血所致高胆红素血症的作用。

KEGG分析核心靶点通过胆汁分泌、HIF-1信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等通路发挥治疗作用；有研究显示，炎症介质既可作为NF-κB信号通路的靶向基因，又可激活NF-κB信号通路，当肝脏损伤时，NF-κB信号通路可参与调控炎症因子的产生主要信号通路[24-25]。有大量研究表明，NF-κB信号通路可被TNF-α、IL-1β等因子诱导激活，因此可通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-16等炎症因子的表达，下调NF-κB信号通路的相关蛋白改善肝脏损伤[26-27]。HIF-1的表达受氧浓度的影响，可通过调控下游蛋白，参与细胞增殖、细胞凋亡等生理过程，作为内源性保护机制的始动因子和共同途径。HIF-1与PI3K/Akt信号通路关系密切。有研究表明，右美托咪定可通过激活PI3K/Akt信号通路减少梗阻性黄疸的肝细胞凋亡[28-29]。

苹果中筛选的活性指标槲皮素、2α-羟基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表儿茶素分别和中度值排名前5的关键核心靶标（AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3）进行分子对接，大部分对接结果的结合能小于-4.0 kcal/mol，这表明苹果筛选的活性成分和获得的治疗溶血所致高胆红素血症潜在靶标有较强的亲和能力。AE中有槲皮素、表儿茶素、根皮素、β-谷甾醇等活性组分，结合网络药理学的分析结果，这些组分对溶血所致高胆红素血症起重要作用。

盐酸苯肼进入腹腔吸收入血后，能迅速与HB形成高铁血红蛋白并生成海因兹小体；生成的海因兹小体沉积在细胞膜上，使其流动性下降、渗透性增加，并可裂解部分细胞膜功能，导致溶血发生[30]，而盐酸苯肼本身并无明显神经毒性，故能较好地模拟新生儿溶血致高胆红素血症的生理过程。在人体中，胆红素主要经人体的肝脏代谢，代谢的过程中需要多种酶的参与完成。当患高胆红素血症时，体内三磷酸腺苷的活性和心肌细胞对氧的摄取受到抑制，导致大量氧自由基堆积，可造成心肌损伤[31]；ALT和AST是肝细胞受损、心肌受损的标志，因此造模成功后大鼠的HB水平下降，TB、IB、ALT、AST的水平升高；肝组织病理切片显示，模型组出现淤血和点状坏死，其炎症因子TNF-α、IL-6水平增高。用茵栀黄注射液和AE干预后HB水平升高，其他指标下降，肝细胞轻度水肿。网络分析结果与动物实验结果相一致，说明茵栀黄注射液和AE对溶血所致的高胆红素血症有治疗作用。

综上所述，本研究基于网络药理学、分子对接、动物实验探讨了苹果治疗溶血所致高胆红素血症可能的活性成分、疾病靶点及通路、筛选的指标性成分与蛋白的相互作用，AE对溶血所致高胆红素血症有治疗作用，所得结果为进一步的实验、临床研究提供了理论方向。但对于关键蛋白、预测的信号通路还需进一步通过实验验证。