基于MAPK信号通路探讨中医药治疗肝癌的研究进展

张格松 蒋士卿

肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一,其分子机制尚未完全明了。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一,在细胞的生长、分化、凋亡和死亡过程中起着至关重要的作用[1]。肝癌的发生、发展、侵袭和转移都与MAPK信号通路的异常活化密切相关[2]。大量临床实践已证实,中医药在预防肝癌发生、抑制复发转移、减轻疾病痛苦、延长寿命等方面有着独特的优势。中医药治疗是肝癌综合治疗的一个重要组成部分,应当参与肝癌防治的全过程,也是提高肝癌综合疗效的重要途径之一[3]。本文概述中医药通过干预MAPK通路及有关靶蛋白治疗肝癌的机制,以期为中医药干预肝癌临床与科研提供更多思路。

MAPK是一种广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可将细胞外的多种刺激传导至细胞内介导各种细胞反应。目前研究发现的MAPK家族信号通路主要有细胞外信号调控激酶1/2(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)以及细胞外信号调控激酶5(ERK5)四条途径,尽管每条MAPK通路都具有其独特的特征,但迄今为止所研究的MAPK通路都存在着许多共性,都是通过三级激酶级联反应的方式将细胞外的信号传达至细胞内,从而调节细胞的生长、分化、凋亡等多种生理和病理过程[4]。目前,ERK1/2、p38、JNK这三条通路研究最广泛,每条通路可以由不同的刺激因素激活,具有相对独立的功能,但这些通路之间也存在着广泛的相关性,具有相互协同或抑制的作用[5]。

根据肝癌的病因及其临床表现,可以将其归为中医的“肝积”“臌胀”“黄疸”“胁痛”等病范畴。肝癌为有形之结块积聚于胁下,由于阴阳失和、情志失调、饮食劳倦等原因导致脏腑功能失司,气血津液运行失常,产生气滞、血瘀、痰凝等病理产物,蕴结于脏腑,相互搏结,日久化为癌毒,癌毒渐耗正气,邪毒趁虚而入,凝于肝胆,久而为积,肝癌乃成[6]。肝癌初期病机以肝失疏泄,气机郁结为主,本期可无临床症状,难以发现;由于肝病易传于脾,中期多为肝脾同病,木郁土虚,本期常有腹胀、纳差、腹泻等表现,临床中也发现肝癌患者多以消化道症状为首发表现;晚期癌毒扩散,正虚邪盛,精气血虚极,肝脾肾同病[7]。中医药治疗肝癌重视辨证论治,合理配伍用药,攻补兼施,标本兼顾,在减轻病人疾病痛苦、抑制肿瘤复发、延长寿命等方面具有极大的优势。

1 中药基于MAPK信号通路诱导肝癌细胞凋亡的机制研究

细胞凋亡对机体的组织分化、器官发育和稳态维持有着重要的意义,而肿瘤细胞可使凋亡信号失调,异常激活抗凋亡系统,逃避凋亡或程序性细胞死亡,从而导致恶性肿瘤发生发展。目前,研究最广泛的凋亡蛋白有半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族。MAPK通路可以调节促凋亡蛋白(如Bax、Bad等)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL等)的表达,当促凋亡蛋白表达相对增加时会导致线粒体外膜的通透性增加,从而诱发细胞色素c的释放,进一步激活Caspase级联反应导致细胞凋亡[8]。

吴茱萸碱是吴茱萸发挥抗肿瘤作用的主要成分,黎彩云[9]通过体内和体外实验发现吴茱萸碱可以抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡,并证实其是通过激活ERK、p38MAPK信号通路和上调促进凋亡Cleaved parp蛋白下调抑制凋亡Bcl-2蛋白表达,来实现抗肝癌作用。He J等[10]发现淫羊藿苷可以增加人肝癌HepG2细胞中的Bax/Bcl-2比率和激活Caspase-3诱导细胞凋亡,并同时上调JNK1的表达,使用JNK通路特异性抑制剂SP600125后淫羊藿苷诱导细胞凋亡的作用被抑制;说明淫羊藿苷通过激活JNK通路来诱导肝癌细胞凋亡。Wang WZ等[11]人研究发现经姜黄素处理后的人肝癌Huh7细胞中p38MAPK信号通路迅速激活,同时Huh7细胞中的Fas和其配体FasL快速显着增加并激活Caspase-3,当使用p38MAPK通路抑制剂SB203580后肝癌细胞中Fas、FasL、Caspase-3表达显著降低;由此证明姜黄素通过激活p38MAPK信号通路上调Fas、FasL、Caspase-3蛋白的表达从而诱导细胞凋亡。Lin W等[12]人通过体内外实验发现,大黄素可以上调肝癌细胞中ERK、p38的磷酸化并轻度抑制JNK磷酸化,体内实验结果发现大黄素以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长并可抑制小鼠的肺转移;研究证明大黄素在体外和体内均可抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与MAPK信号通路转导有关。

鳖甲煎丸首载于《金匮要略》,全方攻补兼施、气血并调,具有破血消癥、益气补血之功。常欣峰[13]通过体内和体外实验发现,鳖甲煎丸通过阻滞ERK信号通路,激活JNK信号通路,同时提高促凋亡蛋白Bax的表达和降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,来促进肿瘤细胞凋亡,起到抗肝癌作用。沈政洁[14]通过Meta分析发现艾迪注射液可以提高肝癌患者生活质量、增强免疫力、降低甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)水平、延长生存期;设计体外细胞实验证明,艾迪注射液能够通过抑制ERK1/2通路和激活p38MAPK、JNK通路来下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达和上调促凋亡蛋白Bak、Bid、Bax的表达,从而诱导肝癌细胞凋亡。

2 中药基于MAPK信号通路抑制肝癌细胞增殖的机制研究

肿瘤发生的关键在于破坏正常的细胞周期,导致细胞发生恶性增殖,丧失分化能力[15]。细胞周期受多条信号分子和周期蛋白的调控,而MAPK信号通路可以通过调节周期蛋白D(cyclin D)的表达,从而影响细胞增殖[16]。cyclin D是细胞周期蛋白家族的一员,可由促有丝分裂生长因子激活,当细胞生长因子刺激时,通过MAPK通路将增殖信号传递至细胞内部,从而使cyclin D合成的增加,cyclin D与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)结合形成复合物,使下游的蛋白质Rb磷酸化,从而启动细胞DNA复制,推动细胞周期由G1期进入S期,促进细胞增殖[17]。

张丰华等[18]研究发现柴胡皂苷D(saikosaponin D,SSD)对SMMC-7721肝癌细胞具有明显的增殖抑制作用且抑制率与SSD的浓度呈正相关;采用流式细胞仪分析发现SMMC-7721肝癌细胞周期明显阻滞于G0/G1期;其机制可能与上调p38MAPK通路的表达有关,p38MAPK的活化可以抑制cyclin D的表达,阻滞细胞通过G1的检验点进入S期[19],从而使细胞分裂停滞于G0/G1期—抑制细胞增殖,发挥抗癌作用。WU WS[20]研究发现柴胡皂苷A(saikosaponin A, SSA)对肝癌细胞的生长也具有抑制作用,这主要是因为SSA可以磷酸化激活ERK,而活化的ERK又可以激活p15(INK4b)和p16(INK4a)表达,p15和p16通过与cyclin D竞争性结合CDKs导致cyclin D无法发挥其作用[21],从而阻滞细胞由G1期进入S期,抑制肝癌细胞的增殖。斑蝥素酸镁是斑蝥体内强效抗肿瘤活性成分,刘云等[22]发现斑蝥素酸镁可以抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)活性,而PP2A对MAPK信号通路具有调节作用[23],同时发现经斑蝥素酸镁处理后的肝癌细胞中ERK1/2磷酸化水平显著下调;由此推测斑蝥素酸镁可以通过抑制PP2A活性来阻滞ERK1/2信号通路传导,进而抑制肝癌细胞增殖。

大柴胡汤出自《伤寒杂病论》,具有和解少阳,清泻阳明之功,常用于治疗肝癌。乔曦等[24]采用体外细胞培养技术发现,大柴胡汤能够浓度和时间依赖性地抑制肝癌Hepa1-6细胞恶性增殖,并可抑制ERK1/2、JNK、p38MAPK、STAT3蛋白的磷酸化表达;又建立肝癌小鼠模型,经大柴胡汤干预后模型小鼠体内肿瘤体积较前缩小,肝癌组织中的p38MAPK、STAT3磷酸化表达降低,但ERK1/2、JNK磷酸化无明显改变;通过体内和体外实验证明,大柴胡汤可能通过下调p38MAPK和STAT3通路的表达来抑制肝癌的发生发展。

3 中药基于MAPK信号通路抑制肝癌细胞侵袭、转移的机制研究

侵袭和转移是恶性肿瘤的特性,也是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一。恶性肿瘤的侵袭是发生转移的前提,肿瘤的转移过程复杂,主要受细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解、血管生成、上皮—间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等多种因素影响[25]。

恶性肿瘤发生侵袭和转移首先要突破ECM,而降解ECM需要多种特异性蛋白酶发挥作用,其中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)在此过程中发挥了重要作用[26],而MAPK通路的激活可以促进MMP的表达[27]。Chiu YW等[28]发现,经黄芩素处理后的肝癌细胞生长受到抑制、细胞的侵袭能力显著下降、迁移水平降低;黄芩素还可降低肝癌细胞中MMP-2、MMP-9的活性以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和p38蛋白的的磷酸化水平;这表明黄芩素抑制人肝癌细胞增殖、侵袭、转移的能力与降低p38MAPK通路活性有关。路景涛[29]研究发现,芍药苷能够抑制肝癌细胞的侵袭、转移,其作用机制可能与抑制ERK通路的传导和降低MMP-9蛋白的表达有关。蟾毒灵是中药蟾酥的提取物,通过体内和体外实验证实蟾毒灵能够通过抑制ERK通路和激活JNK、p38通路来上调促凋亡蛋白Bax的表达和抑制MMP-2的表达,从而发挥其抑制肝癌细胞增殖、侵袭和转移的作用[30]。人参皂苷Rh2作为人参总皂苷成分之一,可以抑制肝癌Hep G2细胞的迁移,其作用机制主要是通过MAPK通路抑制AP1转录因子从而降低MMP3的表达来实现的[31]。

新血管生成为肿瘤的侵袭和转移提供足够的营养保障,在新血管的形成过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)发挥重要作用,VEGF尤其受体结合后又可进一步激活ERK1/2通路加速肿瘤发展[32]。壁虎粗多肽由壁虎醇提物经盐析、透析得到的粗提产品;研究发现,壁虎粗多肽可以通过抑制淋巴管生成来发挥抑制肝癌HepG2细胞的增殖和转移作用,其机制与抑制血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达和下调p-ERK1/2、p-p38MAPK的表达有关[33]。传统中草药南蛇藤具有祛风除湿、活血止痛的作用;研究发现南蛇藤提取物可以抑制肝癌淋巴管的生成,具有抗肝癌的作用,其机制可能与抑制ERK1/2及PI3K/Akt通路的传导和下调VEGF-C表达相关[34]。

EMT是上皮细胞获得间质特征的过程,EMT后细胞的黏附性和极性降低从而导致细胞的侵袭性和迁移性增强,因此抑制细胞EMT对恶性肿瘤的治疗具有重要意义[35]。SNAIL1是转录因子的一员,对于诱导和维持EMT至关重要,ERK信号通路的激活可以稳定SNAIL1的表达诱导细胞EMT[36]。迷迭香酸为中药石见穿中主要活性成分,具有良好的抗肿瘤效果;研究发现迷迭香酸具有抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用,其作用机制与抑制ERK、Akt、Smad2/3信号通路的传导和抑制肝癌细胞EMT有关[37]。地五养肝胶囊为湖北省中医院研制的院内制剂,由熟地黄、五味子、茵陈、姜黄、甘草组成,有补肾养肝、活血通络的功效,临床常用于治疗慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。研究发现,地五养肝胶囊可以抑制肝细胞EMT而促进间质—上皮转化(epithelial-mesenchymal transition, MET),并能通过下调Ras/Raf/Mek/ERK和JAK/STAT信号通路的表达来发挥其抑制肝癌发生发展作用[38]。Qu J等[39]人研究发现,姜黄素和重组人腺病毒p53(rAd-p53)联合使用可以通过调节肝癌细胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK信号通路来抑制肝癌细胞EMT,与rAd-p53或姜黄素单独治疗相比,二者联合使用增强了抑制EMT作用。

4 中药基于MAPK信号通路促进肝癌细胞自噬的机制研究

细胞自噬可以将错误折叠的蛋白质、受损或老化的细胞器和突变的蛋白质隔离在称为自噬体的双膜囊泡中,最终融合到溶酶体,导致隔离成分的降解,是维持细胞稳态、实现细胞代谢和某些细胞器更新的重要途径[40]。当细胞自噬功能抑制或缺陷时,会使自噬介导的细胞垃圾处理失败,导致细胞和组织进行性损伤,从而引发慢性组织损伤和炎症,这与DNA损伤和活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的产生密切相关,有助于引发癌症和促进肿瘤进展[41]。MAPK信号通路可以影响Bcl-2、Bcl-xL磷酸化,进一步影响自噬蛋白Beclin-1从Beclin-1-Bcl-2/Bcl-xL复合物中分离,游离的Beclin1可以募集并激活hVps34蛋白并能与之结合复合物,该复合物在促自噬体蛋白结构形成和吞噬泡组装中起着至关重要的作用[42]。

白花丹醌是从植物药材白花丹中分离提纯所得,具有抗肿瘤、抗炎、杀菌等作用;研究发现,经白花丹醌处理后的肝癌细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG5、ATG7表达增加,并可观察到自噬液泡的形成,从而诱导肝癌细胞凋亡与自噬,其分子机制可能与抑制p38MAPK与PI3K/Akt/mTOR信号通路的相关蛋白磷酸化有关[43]。槐耳是一种药用真菌,具有抗癌、止血、止痢之功;研究发现槐耳可以显著提高肝癌细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin1的表达量,诱导肝癌细胞发生自噬,其作用机制与与抑制p38MAPK信号通路的传导有关[44]。Wang N等[45]发现黄连素可以通过激活p38 MAPK和抑制Akt通路传导,从而上调自噬相关蛋白Beclin1的表达来诱导肝癌细胞诱导自噬性死亡。疏肝祛瘀解毒方是由广东省名中医林丽珠教授所创的肝癌经验方,由柴胡、白芍、枳壳、桃仁、山慈菇等药物组成。前期网络药理学研究显示,疏肝祛瘀解毒方可能通过调控Ras/MAPK信号通路来发挥其抗癌作用;后期通过体外细胞实验发现,疏肝祛瘀解毒方含药血清作用于人肝癌HepG2细胞24小时后可以激活Ras/MAPK信号通路和诱导细胞自噬,48小时后可以抑制Ras/MAPK信号通路并能诱导细胞凋亡;以上研究结果表明疏肝祛瘀解毒方可以双向调节Ras/MAPK信号通路,早期激活肝癌细胞自噬,晚期诱导肝癌细胞凋亡[46]。

5 小结与展望

目前,现代医学对于肝癌的治疗以手术、放化疗、介入治疗、局部消融等综合疗法为主,这些疗法在治疗肝癌的同时也带来了许多毒副反应,轻者降低生活质量,重者放弃治疗。随着近年来对肝癌发病机制的研究逐渐深入,已经证实MAPK信号通路在肝癌的发生发展中起到关键性作用,因此通过调节MAPK信号通路的表达可能成为防治肝癌的新方法、新思路。大量研究已证实,多种中药单体及其活性物质、中药复方、中成药可通过调节MAPK信号通路来抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡与自噬,影响肝癌侵袭与转移。

中医药基于MAPK信号通路治疗肝癌的研究也存在这一些不足:(1)研究主要集中于中药单体及其活性物质,对经典方剂的研究较少。(2)在多数研究中,仅是得到抗肝癌作用与通路中关键蛋白的表达水平相关,但进一步的作用机制研究较少。(3)在一些研究中发现,中医药可以同时干预两条及以上通路,但研究并未深入探讨通路之间的相互作用。(4)中医外治法(如:针灸、艾灸、穴位敷贴等)对肝癌的治疗也具有良好疗效,但现无关于中医外治法通过MAPK信号通路治疗肝癌的机制研究,有待拓展。(5)研究局限于细胞实验和动物实验,缺乏高质量的临床对照试验来验证。虽然本类研究存在着许多不足,但随着研究的不断深入,中医药必将为肝癌患者带来更多希望。