环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用*

廖 川,梁丽娜,黄少宇,马梦霞,李雪斌 综述,韦贵将△ 审校

1.右江民族医学院附属医院医学检验中心/广西高校高发病临床分子诊断研究重点实验室/百色市高发病临床分子诊断与研发重点实验室,广西百色 533000;2.广西壮族自治区田东县人民医院医学检验科,广西百色 533000;3.右江民族医学院医学检验学院,广西百色 533000;4.右江民族医学院附属医院神经内科,广西百色 533000

病原微生物是指能够引起人和动物疾病的微小生物,对人类健康具有极大的威胁。临床上很多常见疾病都是病原微生物感染导致的,如各种病毒性肝炎、结核病、新型冠状病毒感染等,这类疾病通常都具有一定的传染性,有的甚至可以造成世界范围的大流行。因此,临床迫切需要一种能够准确、高效、快速、简便地识别相关病原体的检测方法。

随着分子生物学研究的不断深入,核酸扩增技术在诊断领域的应用越来越广泛。其中最具代表性的是聚合酶链反应(PCR),它能在短时间内对靶标完成指数级扩增,且具有较高的灵敏度和特异度[1],因此很多病原微生物检测都将其作为诊断的参考标准。然而,PCR需要经历变温过程,对设备和操作者要求较高,从而导致其在欠发达地区和现场实施检测上的应用受到一定的限制。而等温扩增技术的出现就很好地解决了这一问题,该技术在恒定温度下即可完成扩增反应,摆脱了对高精密热循环仪的依赖,有望取代PCR在诊断领域的地位。环介导等温扩增(LAMP)是由日本荣研株式会社NOTOMI等[2]于2000年研发,是一种较为成熟的等温扩增法,具有高效、快速、灵敏度高、特异性度强等优点,因此被应用于医学领域中细菌、病毒、寄生虫的检测[3-4]。

1 LAMP的反应原理与特点

1.1LAMP的反应原理 LAMP的扩增过程可以分为两个阶段,即起始阶段和扩增循环阶段[2],扩增完成后可与多种技术相结合实现扩增产物的检测,不同的技术有不同的检测原理,如试纸条法、荧光法等,本文主要讲述LAMP的扩增原理。在扩增的过程中需要引物的参与,和其他扩增方法不同的是,LAMP需要设计2对引物,即内部引物(FIP/BIP)和外部引物(F3/B3),通过这两对引物对靶基因的6个不同区域(F1-F1c、F2-F2c、F3-F3c、B1-B1c、B2-B2c、B3-B3c)特异性识别,因此LAMP具有极强的特异性。

在起始阶段,当温度达到60～65 ℃时,双链DNA处于解旋与结合的不稳态,其中上游内部引物FIP中的F2序列区段首先与模板目标区段的单链DNA中的F2c结合,在Bst DNA聚合酶的作用下自F2的3′末端延伸启动链置换DNA合成。外引物F3则与模板F3c结合并延伸,置换出由FIP链接的互补单链DNA,此单链的F1c与F1区段为互补结构,可通过自我碱基配对形成环状结构。以上述步骤中合成的5′端以茎环状结构的单联DNA为模板,下游内部引物BIP的B2序列区段与单链DNA模板的B2c结合,在Bst DNA聚合酶的作用下启动链置换反应,自B2的3′末端开始延伸合成DNA。外引物B3则与模板B3c结合并延伸,置换出由BIP链接的互补单链DNA,此单链的F1与F1c区段互补,B1c与B1区段互补,形成哑铃状结构的单链DNA。哑铃状结构以3′末端的F1区段为起点,以自身为模板进行DNA合成。由此,哑铃状结构转变为茎环状结构,LAMP扩增进入循环阶段。循环阶段以起始阶段形成的单链DNA为模板,在内部引物与Bst DNA聚合酶的作用下,反复进行延伸和链置换反应,最终产生大量具有多个靶标反向重复序列的茎环DNA结构[2]。

1.2LAMP的特点 LAMP不需要进行高温变性,整个过程在60～65 ℃反应60 min即可完成。与其他核酸扩增法相比,LAMP具有更高的特异性和抗干扰性,因为它是通过2对引物特异性识别靶基因上的6个不同区域来启动反应。此外,LAMP的灵敏度也很高,能够在短时间内扩增出1×107～1×1010数量级的产物,比常规PCR高100倍左右[5],有报道指出LAMP最低可检测10个基因拷贝或更低的检测限[6]。而且LAMP对设备要求不高,一般的水浴锅即可满足需求。因此,LAMP具有高效、灵敏度高、特异性强、简便等优点。当然,LAMP也有其不足之处:首先,LAMP反应需要2对引物参与,因此对引物设计要求较高,如果引物设计不合理,就可能产生非特异性扩增片段影响结果的正确性。其次,由于LAMP的灵敏度很高,在反应过程中易产生气溶胶污染,导致假阳性结果。最后,由于LAMP的扩增产物是长短不一且含有大量茎环结构的DNA双链,因此很难对其扩增产物进行定量分析。

2 LAMP技术在病原微生物临床检测中的应用

目前,临床上对于病原微生物感染的诊断方法主要有培养法、血清学方法及PCR。但这些方法都有其不足之处:培养法耗时较长;血清学方法特异度不高,易产生假阳性结果;PCR对设备和实验环境要求较高。而LAMP因其具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,有望取代传统技术在病原微生物检测中的地位。

2.1LAMP技术在新型冠状病毒检测中的应用 新型冠状病毒感染者主要表现为发热、咳嗽,严重者会休克甚至死亡。虽然目前已经上市了大量的疫苗,但对新型冠状病毒快速、准确、高效地诊断仍然是疫情防控的关键。实时反转录PCR因具有特异性强、灵敏度高等优点,被视为诊断新型冠状病毒感染的金标准[7],但它耗时较长,而且对设备和操作人员的要求也较高,因此在资源匮乏地区和现场实时检测新型冠状病毒的应用方面受到一定的限制。LAMP作为一种恒温扩增法,不仅操作简便,而且其灵敏度不低于反转录PCR[8],因此LAMP可以作为反转录PCR的替代方法以弥补其不足之处。目前,已经有大量基于LAMP的试剂盒被用于新型冠状病毒的检测,Eiken公司开发的LoopampTM新型冠状病毒检测试剂盒基于N基因和RdRp基因设计,通过测量反应体系浊度确定检测结果。为了评估LoopampTM新型冠状病毒检测试剂盒的有效性,YAN等[9]用该试剂盒检测新型冠状病毒,并使用LA-200浊度计对扩增产物进行实时检测,结果表明该反应能够在35 min内检测到水平为10 copy/μL的RNA。HUANG等[4]针对新型冠状病毒的ORF1ab、S、N基因,将比色法与LAMP结合用于检测新型冠状病毒,该方法仅需30 min即可完成检测,通过肉眼判读结果,无须精密仪器,且灵敏度可达80 copy/μL。此外,LAMP还可以和荧光检测[10]、微流控[11]等技术结合用于检测新型冠状病毒。这些方法的建立为新型冠状病毒快速、准确、高效地检测提供了新的思路,也为疫情防控做出了重大贡献。

2.2LAMP技术在结核分枝杆菌检测中的应用 结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌。2020年世界卫生组织(WHO)报告显示,我国结核感染人数位居世界第3位[12]。早期诊断并给予恰当的治疗是控制结核病传播的关键,因此,临床迫切需要寻找一种快速、准确、简单的检测方法。

LAMP能在60～65 ℃的条件下对结核分枝杆菌进行快速检测,1 h即可完成试验[13]。贾枫等[14]通过临床试验对比了抗酸染色法、LAMP法和改良罗氏培养法检测痰标本中结核分枝杆菌的阳性率、灵敏度和特异度。结果表明LAMP法在结核分枝杆菌的诊断中具有快速、灵敏等优点。此外,LAMP对于一些罕见的肺外结核病的诊断也具有很高的价值。KHAN等[15]以mpt64和pstS1为靶点,建立了多靶点LAMP检测骨关节结核患者结核分枝杆菌的方法,结果表明多靶点LAMP在骨关节结核总病例中的灵敏度显著高于多重PCR和GeneXpert。SHARMA等[16]采用IS6110和MPB64靶点对35例临床疑似胃肠道结核患者的回盲活检标本和30例非结核对照者的回盲活检标本进行结核分枝杆菌复合体LAMP检测。结果表明,LAMP检测胃肠道结核分枝杆菌的灵敏度明显高于IS6110 PCR和培养法。此外,在结核病的诊断方面,仍有大量基于LAMP的新技术不断被开发出来。如将LAMP技术与基于纳米颗粒的侧流装置(LFD)[17]及微流控芯片[18]等技术的联合应用。由此可见LAMP在结核病的诊断发面也有广阔的前景。

2.3LAMP技术在沙门菌检测中的应用 沙门菌是全球最主要的食源性致病菌。若误食含有沙门菌的食物可导致食物中毒,严重者会引发肠胃炎、败血症等症状,若不及时就医甚至会危及生命。因此该菌被世界卫生组织(WHO)列为具有中等乃至严重危害的食源性病原菌[19]。

目前临床上主要通过传统的实验室方法在标本中检测沙门菌。但这些传统的实验室方法操作复杂、耗时较长,需要3 d以上才能通过多个分析步骤获得结果。近年来,随着核酸检测技术的不断发展与完善,许多基于核酸扩增的技术已经被广泛使用,如PCR、实时PCR等,这些方法均能将检测时间缩短到3 d以内[20]。其中PCR虽然灵敏度高,但需要配备训练有素的人员和复杂的热循环仪,这使得其难以在设备不足的实验室和资源匮乏的现场环境中应用。而LAMP作为一种新型的核酸扩增技术,在病原微生物的检测方面有其独特的优势。自2005年LAMP被应用于沙门菌的检测之后,已经开发出数十种基于LAMP的沙门菌检测方法,这给临床早期诊断沙门菌感染带来了新的希望。近年来,随着对LAMP技术的深入研究,大量的商业试剂盒被用于沙门菌的快速检测[21]。此外,还有一些基于LAMP的新技术被开发出来。试纸条作为一种简单、快速的检测方法,常与LAMP技术结合用于现场快速检测,朱传新等[22]建立了环介导核酸恒温扩增结合试纸条(LAMP-LFD)检测技术用于沙门菌的快速检测,30 min内即可完成检测,其灵敏度与PCR相当,为10 copy/μL。DRAZ等[23]将LAMP与酶联免疫吸附试验(ELISA)联合用于检测沙门菌D型血清型菌株,检测灵敏度为1×103CFU/mL,比PCR-ELISA的灵敏度高10倍。DRAZ 等[23]将LAMP与表面增强拉曼技术联合用于检测肠炎沙门菌,其灵敏度比常规PCR高10倍,达到了66 CFU/mL。与PCR相比,LAMP不仅快速、简单,而且具有高灵敏度、高特异度等优点,因此,LAMP技术具有替代传统方法检测沙门菌的潜力。

2.4LAMP技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用 金黄色葡萄球菌是一种常见的机会致病菌,当机体免疫力降低时,它可以迁移到其他组织或器官造成感染,严重者甚至出现菌血症,具有较高的致死率。目前临床上金黄色葡萄球菌的常规检测方法是微生物培养法,这种方法虽然具有较高的灵敏度和准确性,但检测过程烦琐、耗时较长[24]。很多患者因此错过了最佳治疗期。因此,开发一种快速、可靠的检测方法来检测金黄色葡萄球菌是临床上迫切需要的。

近年来,越来越多的分子诊断技术被用于病原微生物的分类鉴定,与培养法相比,分子诊断技术具有快速、准确、灵敏等优点,常见的分子诊断技术有PCR、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、LAMP等。其中PCR在金黄色葡萄球菌的临床标本检测中具有较高的准确率[25],然而,由于需要昂贵的设备和熟练的操作人员,PCR在资源匮乏地区的应用受到一定的限制。LAMP作为一种恒温扩增法,无须昂贵的设备和复杂的操作步骤。WU等[3]开发了一种基于LAMP的可视化检测法,通过使用比色指示剂羟基萘酚蓝目视检测金黄色葡萄球菌,结果表明LAMP的检测限为每反应8 copy或每反应400 CFU。与常规PCR相比,LAMP将检测限降低至1/10。邹作成等[26]也设计了基于nuc基因的LAMP可视化检测法,该方法的检测限可达5.6×101CFU/mL,其灵敏度比常规PCR高出10 000倍。LIM等[27]以金黄色葡萄球菌的spa和arcC基因为靶标,将LAMP与PCR对比,结果表明二者的特异度、阳性预测值和阴性预测值完全一致,LAMP的检测限为2.5 ng/μL或1×102CFU/mL,而PCR的检测限为12.5 ng/μL或1×103CFU/mL。由此可见,在检测金黄色葡萄球菌方面,与PCR相比,LAMP不仅具有同样的特异度和准确率,而且检测时间更短,灵敏度更高。因此LAMP是一种很有前途的快速检测金黄色葡萄球菌的方法。

2.5LAMP技术在乙型肝炎病毒(HBV)检测中的应用 HBV是一种环状部分双链DNA病毒,主要通过血液传播,由于HBV感染早期没有任何症状,且感染者血液内缺乏乙型肝炎表面抗原,HBV-DNA含量较低,因此很难在早期检测到HBV感染。ELISA和实时定量PCR是目前临床检测HBV最常用的方法[28],然而ELISA诊断乙型肝炎的灵敏度非常低[29],实时定量PCR作为ELISA的替代方法,其灵敏度较高,但它对实验设备和环境要求也很高[30],在资源不足的情况下很难满足,因此,需要开发出一种快速、灵敏、特异、易于使用的HBV检测方法。

CHEN等[31]通过使用LAMP检测HBV,该方法可以不用提取DNA直接检测血液中的HBV,其灵敏度为每反应10 copy,与PCR相当。CHEN等[32]设计了一种LAMP与基于纳米颗粒的LFD用于临床上HBV的检测,在60 min内即可完成结果的读取,其灵敏度为每反应7.5 IU。MAITY等[33]同样将LAMP与LFD结合用于检测HBV,结果表明HBV-LAMP-LFD法检测HBV的灵敏度为92%,特异度为100%,检测限低至500 pg/μL。为了更好地评估LAMP对HBV诊断的准确性,CHEN等[34]通过检索Embase、Cochrane Library和PubMed数据库中使用LAMP检测HBV的研究,然后使用QUADAS-2工具提取数据并评估文献质量,分析发现LAMP检测HBV的灵敏度和特异度分别为0.91和0.97,阳性似然比、阴性似然比、诊断优势比分别为16.93、0.08和397.57。由此可见,与PCR相比,LAMP是一种简便、快速、有效的检测HBV的方法。因此,LAMP可以取代其他方法用于临床诊断HBV感染。

2.6LAMP技术在华支睾吸虫检测中的应用 华支睾吸虫又称肝吸虫,是临床上常见的一种人类寄生虫,主要流行于中国、韩国和越南等国家[35]。感染早期无明显症状,随着病情的发展,患者会出现腹部不适、黄疸、发热、呕吐和腹泻等,甚至可能引发癌变,因此华支睾吸虫被WHO的国际癌症研究机构归类为Ⅰ类生物致癌物[36]。

华支睾吸虫的准确诊断对于患者的治疗极为重要,目前临床上主要通过涂片镜检法和血清学方法来诊断华支睾吸虫,但镜检法阳性率较低,因此轻度感染病例可能会被遗漏;而血清学方法又无法判断是既往感染还是现在感染[37]。虽然已经开发出了几种基于PCR的检测方法,但它们的灵敏度和特异度波动较大[38]。近年来,LAMP也被用于华支睾吸虫的检测,RAHMAN等[39]将LAMP用于检测从韩国的华支睾吸虫疫区采集的人粪便样品,并使用Kato-Katz方法和实时PCR作为参考标准,LAMP测定显示灵敏度为97.1%(95%CI:90.1%～99.2%),特异度为100.0%(95%CI:92.9%～100.0%)。此外,朱海等[40]以华支睾吸虫ITS2基因为靶标成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的LAMP方法,该方法对华支睾吸虫成虫DNA的最低检出限可达到3.33×10-4ng/μL,灵敏度和特异度与PCR法一致,均为100%,相对于PCR,LAMP不仅具有很高的灵敏度和特异度,而且操作更加简便、反应时间更短。因此,LAMP完全可以替代其他方法用于临床检测华支睾吸虫。

3 总结与展望

3.1LAMP的优势 LAMP是一种新型的恒温扩增技术,在模板、多条引物及链置换酶的参与下,无须温度循环即可快速完成扩增过程。与PCR相比,LAMP无须精密的控温装置,操作简便、快捷,更适用于资源条件有限的基层医院使用,在病原微生物的现场检测方面有非常广阔的前景。

3.2LAMP的不足 近年来,LAMP技术发展迅速,但仍然面临着许多困难与挑战:(1)由于LAMP技术灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染,加上目前国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题比较严重,因此需要通过设置空白对照确定是否为假阳性,并且在实验过程中使用实时浊度仪,避免开盖导致的污染。(2)LAMP与其他恒温扩增法不同,它需要2对引物参与反应,因此引物设计比较复杂,有些疾病的靶基因可能不适合用LAMP方法检测。(3)由于LAMP技术发展时间较短,因此它的集成检测设备不够成熟、商品化应用有待加强。

3.3未来展望 随着LAMP技术的发展及其与多学科技术的联合创新,上述问题都将会得到解决。总之,LAMP技术作为一种新型核酸扩增检测技术,在现场快速检测和基层应用于诊断病原微生物感染的前景较广阔,但仍需要不断深入研究。