UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析参苓白术散化学成分及入血成分

李雷，张艳丽，陈美庆，白珊珊，王竹君，方海红，欧阳辉（.江西科技师范大学药学院，江西 南昌 33003；.江西中医药大学，江西 南昌 330006）

参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓、甘草、桔梗、莲子、白扁豆、砂仁、山药、薏苡仁10味中药组成，是主治脾胃虚弱，食少便溏，气短咳嗽，肢倦乏力的常用方剂[1]。方中人参、白术、茯苓和甘草健脾补肺益气，山药、薏苡仁、莲子、砂仁、白扁豆健脾止泻；桔梗补益肺气，诸药合用，发挥益气健脾、除湿止泻的功效。参苓白术散具有调节免疫功能、改善肺和胃肠功能，以及抗氧化、抗炎等作用[2-4]，还有改善脂肪代谢紊乱、修复皮肤机械屏障等药理作用[5-6]，对肠易激综合征、慢性萎缩性胃炎、溃疡性结肠炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、糖尿病等疾病具有显著疗效[7-11]。

参苓白术散临床应用广泛，且其单味中药成分报道较多，但整方成分研究较少，只涉及到少数的化学成分。如采用高效液相色谱法测定参苓白术散中的茯苓酸、白术内酯Ⅲ含量[12]；采用气相色谱法测定乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等3种挥发性成分的含量[13]。为了全面了解参苓白术散化学成分及其药效物质基础，亟需建立一种快速有效的分析方法对参苓白术散的化学成分和入血成分进行全面表征。超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱（UPLC-Q-TOFMS/MS）技术具有扫描范围广、灵敏度高、精确度高、速度快等优点，在鉴定未知样品化学成分上应用广泛[14]。本研究通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对参苓白术散所含化学成分进行快速分析鉴定，并通过对比给药后血浆和空白血浆的质谱图，推测出入血原型成分以及代谢产物，以期进一步阐明参苓白术散的药效物质基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器Triple-TOF 5600+高分辨质谱仪（美国AB SCIEX公司）；LC-30AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括CBM-20A Lite型控制器，LC-30AD型泵，DGU-30A3型在线真空脱气机，SIL-30AC型自动进样器，CTO-30A型柱温箱）；电热套（北京中兴伟业有限公司）；HGC-24A氮吹装置（天津恒奥科技发展有限公司）；旋转蒸发仪（上海禾汽玻璃仪器有限公司）。

1.2 材料组方饮片：莲子（批号：221002）、薏苡仁（批号：2109003）、砂仁（批号：220502）、桔梗（批号：220402）、白扁豆（批号：2005004）、茯苓（批号：220402）、人参（批号：210402）、甘草（批号：220402）、白术（批号：220702）、山药（批号：2009001），购于南昌市中侨参茸药房，由江西中医药大学黄小方教授鉴定为合格品；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；超纯水（娃哈哈集团有限公司）。雄性SD大鼠，体质量约200 g，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。实验前适应性喂养1周，自由饮水、饮食，温度23～26℃，相对湿度45%～55%，12 h/12 h昼夜交替。本实验过程对动物处理均符合中国《实验动物管理条例》及江西中医药大学实验动物科技中心伦理委员会相关规定（批件号：BCTG-2016-18）。

2 方法

2.1 参苓白术散水煎液的制备称取人参20 g、茯苓20 g、白术20 g、山药片20 g、白扁豆15 g、莲子10 g、薏苡仁10 g、砂仁10 g、桔梗10 g、甘草20 g，打碎成小块，药物分两次煎煮，首次加入10倍量水浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮30 min取滤液，留药渣；加入8倍量水至药渣中，煮沸后文火煎煮30 min取滤液，弃药渣。合并两次煎煮药液，浓缩药液质量浓度至含生药量1.0 g·mL-1的水煎剂，放置于4℃冰箱中备用。

2.2 供试品溶液的制备量取参苓白术散水煎液3mL，加入甲醇，定容至50 m L，用功率为250 W，频率50 kHz超声处理30min；离心，12 000 r·min-1，10min（离心半径为8 cm），取上清，用0.22μm微孔滤膜滤过后，取滤液即得。

2.3 对照品溶液的制备精密称取一定量的白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、原儿茶酸、芹菜素置于25 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度线，配制为50 mg·L-1的混合对照品溶液，用0.22μm微孔滤膜滤过后，取滤液即得。

2.4 血浆样品的制备与处理取SD大鼠12只，随机分成空白组和给药组，每组6只，禁食12 h（自由饮水），给药组按照10 g·kg-1灌胃给予参苓白术散水煎液，空白组灌胃给予相同体积的生理盐水。分别在给药15、30min和1、2 h后，眼眶取血，以4 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8 cm），取上清液，-80℃冻存备用。将同一组大鼠血浆涡旋混合以减少个体差异，各组取250μL血浆，加入1.2 mL甲醇，涡旋混合3 min，4℃下12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8 cm），取上清液，氮气吹干；残渣用300μL甲醇复溶后，涡旋混合3 min，过0.22μm滤膜，取滤液即得。

2.5 色谱条件色谱柱为AXQUITY UPLCBEH（2.1mm×100mm，1.7μm）；柱温：40℃；流速：0.3mL·min-1；进样量：2μL；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱梯度：0～3 min，5%～20%B；3～26 min，20%～65%B；26～30min，65%～95%B；30～32min，95%～95%B；32～32.1min，95～5%B；32.1～35 min，5%B。

2.6 质谱条件采用电喷雾离子化源（ESI）正、负离子模式扫描，数据扫描范围为m/z50～1 250，离子源温度：550℃，雾化气（GS1）和辅助气（GS2）气压均为55 psi，气帘气流（CUR）：35 m L·min-1，去簇电压（DP）：±100 V，碰撞能量（CE）：±10 V。

2.7 数据分析处理首先查阅国内外相关文献，建立参苓白术散中药的数据库，然后分析不同类型化合物的质谱裂解规律，推测其化学成分。对比分析参苓白术散及其含药血浆中各化合物的保留时间及二级质谱图，两者共有且二级质谱碎片相同的成分可以确认为含药血浆中的原型成分。通过文献报道并结合入血原型成分的结构特点和质谱裂解规律，分析推测入血成分的代谢产物。

3 结果

3.1 UPLC-Q-TOF-M S/MS总离子流图的采集在正、负离子模式下对参苓白术散提取液、空白血浆、含药血浆采集总离子流图。见图1和图2。

注：A.参苓白术散；B.空白血浆；C.参苓白术散含药血浆图1 正离子模式下参苓白术散的总离子流图Figure 1 TIC of Shenling Baizhu San in positive ionmode

3.2 参苓白术散成分分析通过与自建数据库、对照品信息相比对，对参苓白术散总离子流图中的各离子峰进行鉴定，利用Peak View 1.2质谱图分析软件分析化合物的保留时间、精确相对分子质量和碎片离子信息，结合相关研究[15-20]，最终鉴定出104个化学成分，其中黄酮类63个、有机酸类14个、萜类13个、香豆素类5个、其他类9个。结果见表1。

3.2.1黄酮类成分 黄酮类成分易发生狄尔斯-阿德尔反应（RDA）裂解、脱甲基、脱羰基、糖苷键的断裂等。以化合物74为例，分子式为C21H22O5，其保留时间为16.69 min，准分子离子峰为m/z353.140 2[MH]-，二级碎片离子为m/z338.115 5[M-H-CH2]-、m/z283.061 2[M-H-CH2-C4H8]-、m/z270.053 3[M-HC2H4-C4H8]-和m/z119.030 1[M-H-C15H18O3]-，结合参考文献[21-22]和自建数据库，推测化合物74为去氢粗毛甘草素C。其可能的裂解途径见图3。

图3 化合物74可能的裂解途径Figure 3 Possible fragmentation pathways for compound 74

3.2.2有机酸类成分 有机酸类成分易发生脱羧、脱甲基等反应。以化合物20为例，分子式为C9H8O3，其保留时间为4.33 min，准分子离子峰为m/z162.896 8[M-H]-，二级碎片离子为m/z119.050 4[MH-COOH]-、m/z93.036 1[M-H-COOH-C2H2]-，结合参考文献[22]和自建数据库，推测化合物20为对羟基肉桂酸。其可能的裂解途径见图4。

图4 化合物20可能的裂解途径Figure 4 Possible fragmentation pathways for compound 20

3.2.3萜类化合物 以化合物72为例，分子式为C15H18O2，其保留时间为16.44 min，准分子离子峰为m/z231.138 1[M+H]+，二级碎片离子为m/z203.145 7[M+H-CO]+、m/z163.077 0[M+H-C5H8]+、m/z119.084 5[M+H-C5H8-CO2]+、m/z105.070 5[M+HC5H8-CO2-CH2]+、m/z189.091 1[M+H-C3H6]+和m/z175.074 4[M+H-C3H6-CH2]+，结合参考文献[23]和自建数据库，推测化合物72为白术内酯Ⅰ。其可能的裂解途径见图5。

图5 化合物72可能的裂解途径Figure 5 Possible fragmentation pathways for compound 72

3.2.4香豆素类化合物 以化合物73为例，分子式为C21H20O6，其保留时间为16.49 min，准分子离子峰为m/z369.133 2[M+H]+，二级碎片离子为m/z313.072 0[M+H-C4H8]+、m/z285.075 1[M+H-C4H8-CO]+、m/z270.052 9[M+H-C4H8-CO-CH3]+，结合参考文献[21]和相关数据库，推测该化合物为甘草香豆素。其可能的裂解途径见图6。

图6 化合物73可能的裂解途径Figure 6 Possible fragmentation pathways for compound 73

3.3 入血原型成分通过对比参苓白术散灌胃大鼠给药血浆和空白血浆总离子流图，结合二级碎片、保留时间以及自建数据库，共推测出入血原型成分11个。结果见表2。

表2 大鼠血浆中原型入血成分鉴定Table 2 Identification of blood components in rat plasma

3.4 入血代谢成分入血原型成分在体内经过一系列代谢反应生成代谢产物，共鉴定出17个代谢产物。结果见表3。主要代谢途径包括甲基化、还原、双还原等Ⅰ相代谢和葡萄糖醛酸化、磺酸化等Ⅱ相代谢反应。其主要代谢途径见图7～图10。

表3 大鼠血浆中代谢成分分析的鉴定结果Table 3 Identification results ofmetabolic components in rat plasma

注：1.甲基化；2.磺酸化图7 M 12可能的代谢途径Figure 7 Possiblemetabolic pathways of M12

注：1.还原；2.磺酸化；3.葡萄糖醛酸化图8 G5可能的代谢途径Figure 8 Possiblemetabolic pathways of G5

M4：保留时间为3.34 min，准分子离子峰为m/z273.007 19[M-H]-，可推测其分子式为C10H10O7S，二级碎片离子m/z193.050 4、178.025 8、149.059 9、134.035 8，与咖啡酸一致，推测该入血成分为咖啡酸甲基化和磺酸化结合产物。同理可推测得到M1。

M10：保留时间为3.34 min，准分子离子峰为m/z333.007 59[M-H]-，可推测其分子式为C15H10O7S，二级碎片离子m/z253.049 5，与大豆苷元一致，推测该入血成分为大豆苷元磺酸化的产物。同理可推测得到M5、M11。

M15：保留时间为8.799 min，准分子离子峰为m/z445.114 5[M-H]-，可推测其分子式为C21H22O10，二级碎片离子m/z172.942 2，与甘草素一致，推测该入血成分为甘草素还原和葡萄糖醛酸化结合产物。见图9。同理可推测得到M7、M9、M14。

注：1. 还原；2.葡萄糖醛酸化；3.磺酸化图9 G6 可能的代谢途径Figure 9 Possible metabolic pathways of G6

注：1. 还原；2. 磺酸化图10 M6 可能的代谢途径Figure 10 Possible metabolic pathways of M6

M2：保留时间为3.09 min，准分子离子峰为m/z165.055 83[M-H]-，可推测其分子式为C9H10O3，二级碎片离子m/z147.898 4、119.050 4，与对羟基肉桂酸一致，推测该入血成分为对羟基肉桂酸还原的产物。

4 讨论

参苓白术散作为除湿止泻名方，具有益气健脾、渗湿止泻等作用。因其化学成分复杂，药效物质基础尚未明确，不利于其临床应用和深入研究。因此，本实验基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定了参苓白术散的化学成分及入血成分，可为其药效物质研究提供科学依据。

本研究从参苓白术散中共鉴定出104个化学成分，包括黄酮类、有机酸类、萜类等化合物。从大鼠血浆中共分离鉴定出11个原型成分，其中芹菜素-7-O-葡萄糖苷、甘草苷、荭草苷、大豆苷元、甘草素、Licoriphenone、黄豆黄苷、异夏佛塔苷为黄酮类，Glyyunnansapogenin E为萜类，原儿茶酸为有机酸类，Licocoumarone为香豆素类。同时鉴定出16个代谢产物，主要为黄酮类化合物和有机酸类化合物经过甲基化、还原等Ⅰ相代谢反应和葡萄糖醛酸化、磺酸化等Ⅱ相代谢反应形成。黄酮类成分甘草素、甘草苷能够抑制叔丁基过氧化氢（t-BHP）处理小鼠模型肝脏中促炎细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α），白细胞介素（IL）-1β和IL-6的表达水平，发挥抗炎作用[24]；大豆苷元能够通过抑制炎症和氧化应激来改善脂多糖（LPS）诱导的肝细胞损伤，具有抗氧化作用[25]。有机酸类成分原儿茶酸通过下调肝脏中的TNF-α表达和大脑中的IL-6/IL-17/IL-23水平，显示出抗炎作用，还可以通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）诱导的细胞凋亡而发挥抗凋亡作用[26]。基于此，推测上述成分可能是参苓白术散的主要药效物质。

综上所述，本研究通过采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法，解析了参苓白术散的化学成分、入血原型成分及代谢产物，有助于阐明参苓白术散的药效物质基础，并为其临床合理应用提供参考。