氨基酸分析在重组蛋白类生物制品质量控制中的应用研究

◎ 魏 欣

（华北制药金坦生物技术股份有限公司，河北 石家庄 050035）

1 氨基酸分析基本原理和方法综述

氨基酸分析是用化学或者生物化学方法准确地确定蛋白质或者多肽的氨基酸成分、顺序和含量。氨基酸分析方法包括高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法、氨基酸自动分析仪法和质谱法等。这些方法可以实现样品的定性与定量分析，从而为深入了解蛋白质结构与功能，提供关键信息[1]。

2 重组蛋白类生物制品的意义及其挑战

重组蛋白类生物制品被广泛用于医学治疗、疫苗开发和诊断试剂中，其结构复杂，且容易受到生产过程的影响，导致产品质量发生变异。因此，保证这类产品的安全非常重要。同时，重组蛋白分子量较大、稳定性较差，且翻译后修饰种类繁多，给其质量控制带来了严峻的挑战。因此，相关机构有必要建立一种严格而有效的检测手段。氨基酸分析能够直观地反映蛋白质一级结构特征，评价重组蛋白类生物制品的纯度、完整性，以及折叠和翻译后的修饰状态。基于此，本研究探索了氨基酸分析技术在重组蛋白类生物制品质量控制方面的运用，以揭示该技术的潜在价值，为重组蛋白类生物制品质量控制体系的进一步优化，提供理论依据与技术支持。

3 氨基酸分析用于重组蛋白类生物制品的质量控制

3.1 序列确认

氨基酸组成及序列分析，对于重组蛋白精确性及一致性的检验至关重要。通过将实际测得氨基酸序列同预期设计理论序列进行比对，能够准确判断蛋白质表达的正确性，评价批次之间的一致性，保证药物有效安全。在重组蛋白类生物制品质量控制过程中，序列确认是保证产品结构正确一致的核心步骤，氨基酸分析技术对这一进程有着至关重要的作用[2]。

3.2 纯度评估

氨基酸含量的比例分析，可以有效反映重组蛋白的纯度高低。通过准确测定目标蛋白各氨基酸的含量，可计算目标蛋白和其他杂质（如宿主细胞的蛋白、降解产物）之间的配比，定量评价产品质量。

3.3 端点氨基酸识别

通过识别N 端、C 端的氨基酸，可以识别重组蛋白能否完成适当的翻译，以及有无截短、延长等现象。同时，N/C 端氨基酸状态可揭示乙酰化和甲基化等翻译、修饰对蛋白质活性的意义。

3.4 疏水性

电荷分布及其他理化性质分析表明，氨基酸组成决定了蛋白质三维结构与功能特性。利用氨基酸分析得到的疏水性和电荷分布等数据，可以间接推测重组蛋白空间构象及稳定性，这对于优化生产工艺、提高产品质量，具有重要参考意义。

3.5 差异性糖基化或者磷酸化位点的检测

蛋白质翻译、修饰后，会显著影响重组蛋白活性、稳定性、药代动力学等。因此，对其进行检测和定量，尤为重要。氨基酸分析可通过对实测氨基酸序列和理论序列进行比较，定位可能存在的糖基化或者磷酸化部位，以保证产品的均一性及临床疗效[3]。

4 将氨基酸分析技术运用于实际案例

4.1 具体事例简介

以重组蛋白食品为例，在此过程中，需先对样品进行提取和纯化，再利用高效液相色谱或者质谱（MS）技术，酶解蛋白质，使蛋白质转化成游离氨基酸混合物。接着，对这几种氨基酸进行定量与定性分析，并测定其组成、顺序及具体氨基酸残基含量。有研究以重组人胰岛素为例，准确测定了各氨基酸所占比例及C 端苏氨酸与A 链、B 链之间二硫键的状态，保证了产物符合天然胰岛素的结构[4]。

4.2 案例研究

根据氨基酸分析数据，可综合评价产品质量。有研究对特定批重组生长激素进行了氨基酸分析，结果表明，目标蛋白具有较高纯度，且氨基酸组成完全符合预期设计，但是疏水性氨基酸所占比例比理论值略大，可能影响药物稳定性。在此基础上，研究学者提出要优化生产工艺，如调节细胞培养条件、完善纯化步骤等，以减少疏水氨基酸片段生成，进而提高产物稳定性及活性。另外，如果检测到有异常糖基化位点时，需要进一步探究糖基化修饰过程中的影响因素，并对生产流程进行调整，以保证产品质量达到预定标准。

5 氨基酸分析技术发展动向及前景

5.1 新型氨基酸分析技术研究与发展动态

近几年，氨基酸分析技术发展迅速。例如，高效液相色谱技术分辨率、灵敏度高，将其与荧光检测及紫外检测相结合，可实现复杂样品氨基酸的准确测定；质谱技术，包括液相色谱-质谱联用（LC-MS）和毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等，可以提供更为全面的氨基酸序列信息及翻译后修饰状态等信息，具有高通量、高精度等特点。此外，串联质谱（MS/MS）、多维蛋白质组学技术等生物质谱新技术，也为氨基酸分析提供了更深入的可能。

①液相色谱-质谱联用技术，将高效液相色谱技术与质谱技术相结合，是氨基酸定量和定性分析的重要方法，其经过样品预处理，衍生化技术及色谱分离条件等优化后，可准确确定蛋白质水解产物氨基酸成分。同时，串联质谱技术进一步增强了对氨基酸序列信息和翻译后修饰位点的识别能力。②毛细管电泳-质谱联用技术，对氨基酸等小分子的快速分离，具有高分辨率、灵敏度高的特点，特别适合复杂生物样品痕量氨基酸的测定，以及对异构体、同分异构体和其他精细结构的判别[5]。③以芯片为核心的微流控技术，可以对样品进行微型化处理分析，极大地减少样本及试剂的消耗，提高分析速度。④多维度蛋白质组学技术将生物质谱、核磁共振（NMR）技术、蛋白质组学数据库和计算生物学方法相结合，为氨基酸组成综合表征提供了一种新的可能性，其既能揭示蛋白质一级结构信息，又能对蛋白质相互作用及其功能状态进行深入研究。

5.2 将氨基酸分析用于重组蛋白类生物制品质量控制的思路

随着氨基酸分析技术的不断发展与进步，其对重组蛋白类生物制品的质量控制作用也愈加突出。一方面，未来有望出现更多针对特殊氨基酸位点（磷酸化、糖基化、甲基化）的特异性分析方法，有助于重组蛋白的翻译后修饰进行全面准确的表征；另一方面，将大数据与人工智能技术相结合，氨基酸分析数据可望形成更加系统化的质量评价体系，以提升产品质量评估智能化程度。与此同时，以单分子分析或者实时监测为基础的新型氨基酸分析技术，有望用于生产过程监控以实现重组蛋白在合成、折叠和修饰等环节中的动态跟踪，可有效优化生产工艺，保证产品质量稳定。

总之，随着科学技术的进步，氨基酸分析用于重组蛋白类生物制品的质量控制，将会更广泛、更深入。通过开发更敏感、特异性更强的质谱技术及手段，有望实现蛋白质糖基化、磷酸化、乙酰化及其他复杂翻译后改造过程的准确定位及定量分析，对于评价重组蛋白的活性和药效，意义重大。

6 结语

氨基酸分析是评价重组蛋白类生物制品核心性质的一种关键技术手段，对于质量控制过程具有重要影响。因此，加大对氨基酸分析技术的研发力度，是增强重组蛋白类生物制品质量控制能力、保障公共健康与生命安全的战略措施之一。