FOXC1人表皮干细胞向汗腺细胞分化的影响

赵亚平 刘坤坤 高玮 高慧 谢淼

人体严重烧伤或创伤常引发皮肤的大面积缺损,而创面修复后患者常因汗腺缺失、分泌管道被瘢痕组织阻塞而无法分泌汗液,引发体温调节障碍[1]。如何实现汗腺修复和皮肤重建是目前医学界关注的重点内容。表皮干细胞与汗腺均来源于外胚层,已有研究显示表皮干细胞能在特定环境及关键因子的诱导下转化为毛囊或皮脂腺,对改善创伤后皮肤重建和排汗功能具有重要意义[2]。叉头框C1(FOXC1)蛋白是转录因子FOX家族重要成员,其可参与调控毛囊干细胞和造血干细胞干性[3,4],但其在表皮干细胞中作用尚不明确。本次研究通过设计合成FOXC1模拟物,通过转染导入表皮干细胞,探究其对表皮干细胞向汗腺细胞分化的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2021年1月至2022年6月于我院泌尿外科行包皮环切术7例患者的正常包皮组织,年龄18～41岁,本研究取得患者知情同意和医院伦理委员会批准。将包皮组织修剪成约1 cm×1 cm大小,加入0.25%胰酶+EDTA消化分离表皮和真皮层,Ⅳ型胶原黏附法分离表皮干细胞,然后在含人重组表皮生长因子(EGF)、K-SFM的培养基中进行培养,定期换液,观察细胞生长情况,待生长至90%融合时消化下来,取二代表皮干细胞进行后续实验,并根据细胞形态学特征及免疫组化检测细胞表型结果以鉴定表皮干细胞,免疫组化检测角蛋白(CK)19、CK18、癌胚抗原(CEA)、β1整合素(ITGB1),以CK19、ITGB1棕黄阳性表达,CK18、CEA阴性表达作为符合表皮干细胞。取处于生长对数期的表皮干细胞,按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将FOXC1 shRNA干扰质粒、pCMV-FOXC1过表达质粒转染至细胞中,并采用嘌呤霉素筛选稳定干扰FOXC1 表达和稳定过表达FOXC1 的细胞,分别作为过表达组和干扰组,另取一组细胞不做处理作为对照组,

1.2 试剂与仪器 胰酶-EDTA、人重组表皮生长因子(EGF)、胶质细胞无血清培养基(K-SFM)、Ⅳ型胶原(均购自美国Gibco公司),FOXC1 shRNA干扰质粒、pCMV-FOXC1过表达质粒(购自美国Origene公司),Lipofectamine 2000转染试剂盒、Trizol试剂(美国赛默飞公司),TTBS液(上海钦诚生物科技有限公司),兔抗人CK19、CK18、CEA、ITGB1、β-actin一抗及IgG-HRP标记的羊抗兔二抗(购自美国Abgent公司),MTT试剂盒(上海超研生物科技有限公司),吉姆萨染液(上海钰博生物科技有限公司);酶标仪(美国赛默飞公司Multiskan FC型),激光共聚焦显微镜(德国徕卡M525 F40型),电泳仪(上海谱振生物科技有限公司JY-1000C型),PCR仪(美国ABI公司9700型)。

1.3 RT-PCR检测细胞FOXC1 mRNA表达 取转染72 h后细胞采用Trizol试剂提取总RNA,并进行纯化和定量。每个样本取2 μg逆转录成cDNA,设计FOXC1及内参β-actin引物,随后进行RT-PCR,反应条件:95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,40 cycles。每个样本重复测定2次,并以2-ΔΔCt法计算FOXC1 mRNA相对表达量。

1.4 Western blot检测细胞目的蛋白表达 取3组转染72 h后细胞中总蛋白,并进行定量。每个样本取50 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳,随后转膜、封闭,分别加入一抗(兔抗人CK19、CK18、CEA、ITGB1、β-actin,稀释比例均为1∶200)并4℃孵育过夜,次日用TTBS将其冲洗后加入IgG-HRP标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)37℃孵育2 h,TTBS冲洗后曝光,系统扫描呈现,采用Image Pro-plus 6.0软件分析灰度值,并以β-actin对比计算目的蛋白的相对表达量。

1.5 MTT实验检测细胞增殖水平 将细胞接种在96孔板中,每隔3天取3孔进行MTT实验,实验前换成新鲜培养液,并加入10% MTT,25℃孵育4 h,用移液枪移去培养基,用PBS洗涤2次,随后加入150 μL二甲基亚砜,震荡5 min,最后用酶标仪测定570 nm处的OD值。

1.6 吉姆萨染色检测细胞克隆形成 转染72h后将细胞消化下来并计数,将细胞接种到6孔板中(每孔约200个),每组设置3个重复孔,在37℃ 5%CO2中培养14 d,然后移液枪移去培养基,甲醇固定10 min后PBS冲洗2次,随后进行吉姆萨染色10 min,将染液冲洗干净后晾干,在显微镜下随机选择10个视野,并计算克隆形成率。

1.7 激光共聚焦显微镜检测Ca2+浓度 采用激光共聚焦显微镜检测细胞中Ca2+浓度,分别于转染前、转染72 h将孔板上细胞制备成细胞悬液,采用Ca2+探针STDIn负载表皮干细胞后在显微镜下观察,每孔随机选择5个视野,每个视野中取10个细胞,测定细胞Ca2+平均荧光像素值。

1.8 ELISA检测培养基上清液中MMP-2、MMP-9表达 收集各组细胞上清液,按照ELISA试剂盒说明书检测培养基上清液中MMP-2、MMP-9浓度,并在450 nm处测得OD值,得到标准曲线及方程(MMP-2:Y=3898.4X-299.6,MMP-7:Y=2010.4X-217.5),并据此计算MMP-2、MMP-9浓度。

2 结果

2.1 3组RT-PCR、Western blot检测FOXC1 mRNA及蛋白表达比较 RT-PCR、Western blot检测显示,与对照组比较,过表达组细胞中FOXC1 mRNA及蛋白相对表达量升高,干扰组中FOXC1 mRNA及蛋白相对表达量降低(P<0.05)。见表1。

表1 3组细胞FOXC1 mRNA及蛋白表达

2.2 3组MTT实验及吉姆萨染色检测细胞增殖、克隆形成率比较 通过观察细胞增殖情况可见,表皮干细胞在接种后第3天进入快速生长期,约第6天到达稳定期,故选择转染时及第3、6、9 天时测定细胞增殖情况。MTT实验及吉姆萨染色结果显示,与对照组比较,过表达组细胞增殖水平、克隆形成率升高,干扰组细胞增殖水平、克隆形成率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组细胞增殖及克隆形成率比较

2.3 3组ELISA检测培养基中MMP-2、MMP-9表达比较 ELISA检测结果显示,与对照组比较,过表达组细胞MMP-2、MMP-9表达量升高(P<0.05),干扰组中MMP-2、MMP-9表达量降低(P<0.05)。见表3。

表3 3组细胞MMP-2、MMP-9表达

2.4 3组激光共聚焦检测细胞内Ca2+浓度比较 激光共聚焦显微镜检测显示,与对照组比较,过表达组细胞中Ca2+荧光强度升高,干扰组中Ca2+荧光强度降低(P<0.05)。见表3。

2.5 3组Western blot检测表皮干细胞分化相关标记蛋白表达比较 Western blot检测结果显示,与对照组比较,过表达组CK18、CEA蛋白表达量升高,ITGB1、CK19蛋白表达量降低(P<0.05),干扰组CK18、CEA蛋白表达量降低,ITGB1、CK19蛋白表达量升高(P<0.05)。见表4。

表4 3组Western blot检测表皮干细胞分化相关标记蛋白表达

3 讨论

大面积烧伤患者创面愈合后其皮肤功能重建问题依然是医学界关注的重点问题,而干细胞移植以诱发汗腺再生是临床皮肤修复重建的新方向[5]。从胚胎发育角度来看,外胚层上皮细胞是表皮干细胞与汗腺细胞的共同起源,能通过不断分裂在表皮嵴形成上皮细胞索,而该细胞索逐渐发育为导管和分泌部,构成汗腺[6]。相关研究显示,汗腺细胞可由表皮干细胞在特定环境下分化而来[7],提示可通过表皮干细胞向汗腺细胞分化来实现汗腺再生。

FOXC1位于人6号染色体上,其结构拥有一个与DNA结合的叉头区域,是一种对器官发育具有重要作用的转录因子[8]。随着近年来分子生物学的进展,通过全基因组大范围筛查转录因子作用规律,已经证实了部分转录因子在调控细胞分化中的作用[8]。此外,对细胞分化起决定性作用的DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学修饰,也受到转录因子与DNA结合影响,故认为转录因子在细胞重编中具有重要作用[9]。目前已经发现FOXC1能通过上调细胞周期蛋白表达来增强肿瘤干细胞活性,还能抑制单核细胞向巨噬细胞分化,同时促进肿瘤干细胞的克隆形成[10]。有研究显示,FOXC1在汗腺细胞中表达明显高于表皮干细胞[11],但关于FOXC1在表皮干细胞中作用及对维持肿瘤干细胞异常增殖的作用机制仍未确定。本次根据FOXC1序列设计模拟物,通过脂质体转染将FOXC1到离体的表皮干细胞中,通过RT-PCR及Western blot测定各组FOXC1表达,且提示转染成功。本次研究发现,转染后过表达组细胞增殖水平、克隆形成率高于对照组,干扰组增殖水平、克隆形成率低于对照组,提示FOXC1可提高表皮干细胞的增殖能力和细胞干性,这对于细胞分化具有重要意义。此外,汗腺的产生除细胞外基质重建和细胞运动两个部分,腺体胚芽细胞下陷生长的同时还能分泌MMP-2、MMP-9等金属基质蛋白酶,从而介导细胞外基质降解,促进下陷生长细胞向表皮层深入生长,最终形成腺体[12,13]。本次研究中过表达组转染后MMP-2、MMP-9水平明显高于对照组,而干扰组MMP-2、MMP-9低于对照组,提示FOXC1可能在促进表皮干细胞细胞外基质降解和下陷生长中起作用。表皮干细胞在个体生长发育的各个阶段广泛存在,具有一定的定向分化能力,而Ca2+浓度升高提示细胞活化,这对细胞生长及分化过程也起到重要作用[14]。转染后过表达组Ca2+荧光强度的提高,提示在FOXC1作用下,表皮干细胞具备了发生部分功能转化的分子基础[15]。ITGB1、CK19是主要在表皮干细胞表达的标记物,而CK18、CEA仅在汗腺中表达[16],本次研究结果显示,过表达组表皮干细胞标记物CK18、CEA蛋白表达量明显高于对照组,在汗腺表达的ITGB1、CK19表达量低于对照组,而干扰组反之,提示FOXC1可在体外促进表皮干细胞向汗腺细胞表型变化。此外,还有研究显示ITGB1、CK19表达上调提示细胞克隆形成及增殖能力的提高[17],这与MTT实验及吉姆萨染色结果一致。相关动物实验显示,在小鼠汗腺发育后期,FOX家族多种蛋白(FOXC a1～a3)能通过Shh通路和EDA通路促进汗腺分泌部的发育和汗液分泌[18],提示FOXC1可能也通过上述通路参与表皮干细胞向汗腺细胞的定向分化,但具体情况有待进一步研究和论证。