锌转运蛋白-9 抑制高脂食物诱导小鼠前列腺炎的机制研究

辛储林 陈名阳 胡亚荣 苏娟 田新雁 李娟

前列腺炎（Prostatitis）是男性泌尿系统的常见病，其在男性人群中的发病率约为30%[1]。据流行病学调查统计，慢性非细菌性前列腺炎是最常见的前列腺炎类型。前列腺组织炎症在一定程度上可以推动良性前列腺增生症（Benign prostatic hyperplasia，BPH）的发生发展，而BPH 是引起男性出现尿路症状最常见的因素[2]。前列腺炎的主要症状表现为盆腔、下腹部疼痛以及性功能障碍[3]，对患者的生命质量及健康造成严重影响[4]，同时长期的前列腺炎可能导致前列腺癌的发生。关于前列腺炎的治疗，临床上只能以改善症状为主，无法根治[5]。因此，研究前列腺炎的发病原因，阐明其具体机制，寻找新的药物治疗靶点，对改善患者疼痛，提高生活质量具有重要的实践指导意义。

高脂食物引起的肥胖与多种疾病密切相关，如慢性肾病[6]、糖尿病[7]以及阿尔茨海默病[8]等。此外，其也与前列腺相关疾病有关。据研究报道，肥胖是男性出现慢性非细菌性前列腺炎的高风险因素之一[9]，腰围和体质量指数与良性前列腺增生之间存在因果关系[10]。高血糖、高血脂会导致男性出现严重的前列腺组织炎症，并能促进良性前列腺增生的发生、发展[11]。

锌是人体中必须的微量元素，具有抗氧化、促进蛋白质合成和酶促反应等重要的生理功能。锌离子的减少会导致人体稳态失衡，导致生长缓慢和糖尿病等多种疾病[11]。此外，锌是免疫系统的重要组成部分，锌缺乏会抑制免疫激活，促进炎症相关因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的分泌，减少抑炎因子的释放，在皮肤炎症、神经炎症和气管炎症等多种炎症中发挥重要作用[12，13]。研究表明锌有助于提高前列腺的免疫功能，能够帮助细胞以健康的方式生长和增殖，从而保护前列腺和性健康[14]。锌转运蛋白-9（Zinc transporter-9，ZnT-9）属于锌转运蛋白家族的重要组成部分，其可以与锌离子融合，负责将细胞胞浆中的锌离子运送到细胞器，对锌发挥正常功能具有重要作用[15]。本研究利用高脂食物诱导小鼠前列腺炎，使用硫酸锌进行灌胃，检测锌是否可以抑制小鼠前列腺炎，并研究前列腺组织中ZnT-9的表达变化情况，从而探究锌改善前列腺炎的相关机制，为前列腺炎的治疗和预防提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物30 只雄性3 周龄C57BL/6 健康小鼠，体质量18～20g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司[SCXK（京）2019-0010]，普通饲养饲料和高脂食物饲料均购自该公司。小鼠饲养于大理大学动物实验楼，5 只/笼，给予充足的新鲜饲料及灭菌水，饲养室温度（21±3）℃，湿度为40%～70%，保证每12h 的光暗循环。小鼠实验操作符合大理大学实验动物伦理要求（伦理批号：2022-PZ-154）。

1.2 药品与试剂生理盐水（山东辰欣药业，2209 250721），硫酸锌溶液（上海阿拉丁，H2231754），4%多聚甲醛固定液（深圳希景生物，220428514），无水乙醇（昆明汕滇药业，20211227），HE 染色试剂盒（武汉博士德，AR1180），免疫组化试剂盒（上海生工生物，D601037-0020），IL-6 抗体（上海碧云天生物，AF7236），TNF-α 抗体（武汉三鹰生物，60291-1-Ig），ZnT-9 抗体（美国圣克鲁斯，sc-271956 HRP）。

1.3 实验仪器动物手术器材（上海金钟医药仪器）、组织包埋机（浙江科迪仪器）、病理切片机（浙江科迪仪器）、小动物电子秤（张家港市青松生物医学仪器）、电子天平（美国奥豪斯仪器）、纯水仪（上海和泰仪器）、烘箱（上海一恒科学仪器）、压力蒸汽灭菌器（上海博迅医疗生物仪器）、动物操作平台（成都泰盟）、光学显微镜（日本奥林巴斯）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物的分组及给药 将30 只小鼠随机分成普通食物组、高脂食物组与高脂食物+锌组，各10 只，将普通食物组视作正常对照。普通食物组小鼠饲喂普通饲料，高脂食物组、高脂食物+锌组小鼠饲喂高脂饲料，喂养1 周待小鼠适应后，给予普通食物组、高脂食物组小鼠生理盐水（20mL·kg-1·d-1）灌胃，高脂食物+锌组小鼠硫酸锌溶液（15mg·kg-1·d-1）灌胃[16]，持续10 周。

1.4.2 获取前列腺组织、计算前列腺指数 待小鼠14 周龄时称重记录后，麻醉处死，将其腹部向上放平固定，剪开下腹部，将膀胱、尿道、储精囊和前列腺全部提起，小心清除临近组织，将前列腺分离出来，用电子天平称重。通过对小鼠前列腺指数（前列腺质量/体质量）进行计算，可以直观掌握小鼠前列腺的增生状况。

1.4.3 制备前列腺组织病理切片行HE 染色 将取下的小鼠前列腺组织放入4%多聚甲醛固定液进行组织固定，4℃保存48h，之后再进行脱水→包埋→切片，然后使用HE 试剂盒中的苏木素、伊红分别对小鼠的前列腺组织进行染色，使用光学显微镜观察小鼠前列腺组织中炎症细胞的浸润情况，并进行拍照。

1.4.4 检测前列腺组织中IL-6、TNF-α 和ZnT-9 表达水平 采用免疫组织化学染色测定各组小鼠前列腺组织中IL-6、TNF-α 和ZnT-9 的表达水平。将小鼠前列腺组织切片放置在65℃烘箱中2h，使用二甲苯进行脱蜡、使用梯度乙醇（100%、95%、80%、70%，浓度从高到低）进行脱水，使用柠檬酸钠（10mmol/L，pH=6.0）缓冲液在高温高压状态下对小鼠前列腺组织进行抗原热修复，之后将小鼠前列腺组织切片浸泡在3%过氧化氢中10min，以去除内源性过氧化物酶，经PBS 漂洗后，加入预先配制好的一抗，放入4℃冰箱中。一抗孵育过夜后回收，滴加二抗，室温孵育2h。之后进行DAB 显色，苏木精浸泡染色，再使用梯度乙醇进行脱水，中性树脂进行封片。然后在光学显微镜下观察细胞阳性信号并拍照，使用Image J 软件统计小鼠前列腺组织中的阳性细胞数并计算百分比。

1.5 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0 软件进行实验数据的统计分析，实验数据均使用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠前列腺指数比较与普通食物组相比，高脂食物组小鼠体质量显著增加（P＜0.001），而与高脂食物组相比，高脂食物+锌组小鼠体质量下降。此外，高脂食物组小鼠前列腺质量显著大于普通食物组（P＜0.001），与高脂食物组相比，高脂食物+锌组前列腺质量显著减小（P＜0.01）。与普通食物组相比，高脂食物组小鼠前列腺指数显著增大（P＜0.01），而与高脂食物组相比，高脂食物+锌组小鼠前列腺指数显著减小（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠的前列腺指数（）

表1 各组小鼠的前列腺指数（）

注：与普通食物组相比，①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001；与高脂食物组相比，④P＜0.05，⑤P＜0.01

2.2 各组小鼠前列腺组织中炎性细胞的浸润情况与普通食物组小鼠相比，高脂食物组小鼠前列腺组织中炎性细胞较多；与高脂食物组相比，高脂食物+锌组小鼠前列腺组织中炎性细胞明显减少。见图1。

图1 前列腺组织的病理切片

2.3 各组小鼠前列腺组织中IL-6 的表达情况高脂食物组小鼠前列腺组织中IL-6 的表达与普通食物组相比显著增加（P＜0.01）；高脂食物+锌组小鼠前列腺组织中IL-6 的表达与高脂食物组相比显著减少（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 各组小鼠前列腺组织中IL-6 的表达情况

表2 各组小鼠前列腺组织中阳性细胞数统计（%，）

表2 各组小鼠前列腺组织中阳性细胞数统计（%，）

注：与普通食物组相比，①P＜0.05，②P＜0.01；与高脂食物组相比，③P＜0.05

2.4 各组小鼠前列腺组织中TNF-α 的表达情况高脂食物组小鼠前列腺组织中TNF-α 的表达与普通食物组相比显著增加（P＜0.05）；与高脂食物组相比，高脂食物+锌组小鼠前列腺组织中TNF-α 的表达显著减少（P＜0.05）。见图3、表2。

图3 各组小鼠前列腺组织中TNF-α 的表达情况

2.5 各组小鼠前列腺组织中ZnT-9 的表达情况高脂食物组的小鼠与普通食物组的小鼠相比，前列腺组织中ZnT-9 的表达水平显著降低（P＜0.01）；与高脂食物组相比，高脂食物+锌组小鼠前列腺组织中ZnT-9 的表达水平显著增加（P＜0.05）。见图4、表2。

图4 各组小鼠前列腺组织中ZnT-9 的表达情况

3 讨论

前列腺炎是男性泌尿系统的常见病，发病率逐年升高，无法根治，严重影响患者的生活质量。前列腺炎的发病机制目前尚不清楚，其致病因素较多，如遗传、年龄和饮食习惯等都和前列腺炎的发生和发展密切相关，其中肥胖、高血糖和高血脂更是诱发前列腺炎的高危因素[2]。有研究发现，高脂食物可增加小鼠前列腺组织中IL-6、TNF-α 和IL-8等炎性细胞因子的表达水平，诱导小鼠前列腺组织产生慢性炎症[11]。本研究选择高脂食物致小鼠前列腺炎的模型，旨在研究肥胖和高脂在前列腺炎中的作用，同时该模型易操作，能很好地模拟慢性前列腺炎，具有很大的实际指导意义。在本研究中，与普通食物组相比，高脂食物组小鼠体质量显著增加，前列腺指数也显著增大。

锌是人体中非常重要的微量元素，在保证人体能够进行正常的生命活动中具有关键作用。研究发现，锌具有抗炎作用，能够抑制C 反应蛋白，IL-6和TNF-α 等炎症因子的形成。锌缺乏会导致皮肤炎、口腔炎和肠炎等多种炎症的发生，同时会增加人体细菌感染导致炎症的概率[17]。此外，多项研究表明锌对多种肥胖相关的并发症都具有改善效果，且锌可以延缓肥胖导致的肾脏病变，而锌缺乏可以加快肥胖导致的心脏肥大等进程[18]。本研究中，高脂食物组小鼠在补锌后，前列腺组织中炎症细胞的浸润减少，IL-6、TNF-α 的表达水平降低，表明锌可以改善小鼠前列腺组织的炎症情况。

锌正常功能的发挥离不开锌转运蛋白的作用，其异常表达已被证明与很多疾病有关，包括糖尿病、癌症和阿尔茨海默症等[19]。研究发现患有糖尿病的大鼠ZnT-1/ZnT-8 表达减少[20]。另外，ZnT-6 表达降低与肥胖导致的小鼠弱精子症密切相关[21]。本研究中，与普通食物组相比，高脂食物组小鼠前列腺组织中ZnT-9 表达显著降低，而高脂食物+锌组小鼠前列腺组织中ZnT-9 表达较高脂食物组增加，说明ZnT-9 表达减少可能与高脂导致的小鼠前列腺炎发生、发展有关，补锌可以上调ZnT-9的表达，从而延缓小鼠前列腺的炎症反应。然而，本研究只是探究了锌对于高脂食物小鼠前列腺炎的抑制作用，发现ZnT-9 表达改变，至于高脂食物如何导致ZnT-9 表达下调以及锌如何通过ZnT-9改善前列腺炎症的具体机制有待于进一步探索。

综上所述，锌可以降低高脂食物小鼠的前列腺指数，减弱前列腺组织中炎症细胞的浸润，降低前列腺组织中炎症细胞因子IL-6、TNF-α 的表达，这可能与上调ZnT-9 的表达有关。