蛇伤胶囊对竹叶青蛇伤兔血小板活化功能影响的研究

邵 丹 吴 晖 梁志奇 吴 丹 陈宏杰 王 榕

福建中医药大学附属人民医院急诊科，福建福州 350004

竹叶青蛇是我国常见的一种血循毒类毒蛇，被竹叶青蛇咬伤的患者表现为咬伤处出血，皮肤可见散在的血水疱或瘀斑，伤肢肿痛明显。前期研究[1-2]表明具有泻火解毒作用的蛇伤胶囊治疗竹叶青蛇伤临床疗效显著，其作用机制与改善血小板形态及其聚集功能密切相关。血小板发生变形、黏附、聚集及活性物质释放反应是血小板活化的重要表现，是机体止血、凝血和血栓形成过程的重要环节[3]。αⅡb整合素（CD41）、整合素β链Ⅲ（CD61）、血小板P选择素（CD62P）、溶酶体颗粒膜糖蛋白（CD63）、膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）是血小板活化的特异性指标，本研究拟通过观察蛇伤胶囊对上述血小板活化相关指标的影响，探寻其纠正竹叶青蛇伤相关凝血障碍的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

选取24只雄性新西兰大白兔，体重2.0 kg，厂家：杭州医学院，许可证号码：SCXK（浙）2019-0002。本研究经福建安布瑞实验动物伦理委员会审核批准（审批号：IACVC FJABR2022021001）。

1.2 实验药物

蛇伤胶囊（闽药制字Z06106044，规格：0.37 g×50粒/瓶）为福建中医药大学附属人民医院院内制剂，组成：大黄、黄连、山慈菇、土木香、白芷、雄黄、冰片等，成人用量5粒/次，4次/d。竹叶青蛇毒冻干粉由鹰潭志远蛇业科技有限公司提供（批号：BS114-10g）。

1.3 实验试剂

血液RNA提取试剂盒由北京百泰克生物技术有限公司提供（批号：RP4001），Plus All-in-one 1st Strand cD DNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）、SYBR qPCR SuperMix Plus由苏州近岸蛋白科技股份有限公司提供（批号分别为E047-01A、E096-01B）；DEPC处理水由大连美仑生物技术有限公司提供（批号：MA0018）；GPⅡb/Ⅲa由上海化邦生物科技有限公司提供（批号：HB-T21367P）。

1.4 实验仪器

DW-HL340超低温冷冻储存箱（中科美菱低温科技股份有限公司），WTL-4K低速迷你离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），Microfuge-22R微量冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司），7300荧光定量PCR仪（美国ABI公司），MultiskanFC型号酶标仪（赛默飞世尔科技公司）。

2 方法

2.1 药剂制备及动物用量

实验中新西兰大白兔给药剂量依据实验动物与人体每公斤体重剂量折算系数表[4]换算，结合既往实验结果[2]确定所用蛇伤胶囊适宜的剂量为348 mg（/kg·d）。临用时用蒸馏水配成适当浓度药液，一般按20～25 ml/（ 只·d） 灌胃，即10 ml/（ kg·d）（成年兔子体重2～2.5 kg），对照组用等量蒸馏水灌胃。

2.2 模型建立及实验分组

竹叶青蛇伤兔模型参照前期实验[2]进行复制，健康新西兰大白兔，体重2.0～2.5 kg，常规饲养1周。将冻干竹叶青蛇毒用灭菌生理盐水先配制成1 mg/ml的蛇毒生理盐水母液，按每公斤体重0.75 mg计算出所需的母液体积，然后用灭菌生理盐水稀释至总量20 ml，由兔耳缘静脉缓慢注入。局部出现红肿提示造模成功。

24只实验兔常规饲养1周，按随机数表法根据体重分为3组，每组各8只，雌雄各半。①正常对照组：兔耳缘静脉注射0.75 mg/kg生理盐水，6 h后予10 ml/（kg·d）生理盐水灌胃。②模型组：兔耳缘静脉注射0.75 mg/kg竹叶青蛇毒液，6 h后予10 ml/（kg·d）生理盐水灌胃。③蛇伤胶囊组：兔耳缘静脉注射0.75 mg/kg竹叶青蛇毒液，6 h后予10 ml/（kg·d）蛇伤胶囊所配药液灌胃。以上3组连续灌胃1周。

2.3 血小板分离提取

用肝素抗凝管兔耳缘静脉采血5 ml，分装至离心管中，加入台氏缓冲液（Tyrode-Buffer）3 ml，后按照1∶1000的比例加入PGE1，在160×g离心力条件下离心12 min，接着移取富含血小板的上层血浆至新的离心管中，按1∶1000的体积加入PGE1，在475×g离心力条件下离心10 min，倒掉上清，每管加入1 ml缓冲液，轻柔地用巴氏吸管吹打重悬血小板。

2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应技术（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）检测CD41、CD61、CD62P、CD63信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表达

上述血小板重悬后，采用Trizol法提取细胞总RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），根据NovoStart®SYBR qPCR 试剂盒说明书制备qPCR反应体系，反应参数为95℃ 1 min、95℃ 20 s、56℃ 20 s、72℃ 38 s，40个循环。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）上游引物5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3’，下游引物5’-AGCATCGAAGGTAGAGGAGTG-3’，CD41上游引物5’-CCTCAAAGTGGAGCACACCT-3’，下游引物5’- GTGGGCAGCCTCCAGTTTAT-3’，CD61上游引物5’- AGCAGTGACTTCGGCAAGAT-3’，下游引物5’-GTCCAGTCGGAGTCACACAG-3’，CD62P上游引物5’-TGTCCTGTAGGCACCATCTG-3’，下游引物5’-CTGCTGTCCATTGTCCTGAAG-3’，CD63上游引物5’-GCCATTGCTGGTTACGTGTT-3’，下游引物5’- GCCCAGTCCGTGTAGTTAGC-3’，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt方法计算CD62P的mRNA表达量。引物合成由福州尚亚生物公司完成。

2.5 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测GPⅡb/Ⅲa水平

按试剂盒说明书标准操作，完成后根据标准曲线公式计算样品浓度，得出GPⅡb/Ⅲa水平。

2.6 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。P＜ 0.05为差异有统计学意义，P＜ 0.01为差异有显著统计学意义。

3 结果

各组血小板细胞CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表达及GPⅡb/Ⅲa水平组间比较，差异均有显著统计学意义（P＜ 0.01）。与正常对照组比较，模型组CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表达及GPⅡb/Ⅲa水平显著降低，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），蛇伤胶囊组CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表达显著降低，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），GPⅡb/Ⅲa水平显著降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与模型组比较，蛇伤胶囊组CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表达显著增加，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），GPⅡb/Ⅲa水平显著增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1。

表1 各组血小板细胞CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表达及GPⅡb/Ⅲa水平比较（）

表1 各组血小板细胞CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表达及GPⅡb/Ⅲa水平比较（）

注 与正常对照组比较，aP ＜ 0.01、cP ＜ 0.05；与模型组比较，bP ＜ 0.01、dP ＜ 0.05；CD41：αⅡb整合素；CD61：整合素β链Ⅲ；CD62P：血小板P选择素；CD63：溶酶体颗粒膜糖蛋白；GPⅡb/Ⅲa：膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa

组别nCD41CD61CD62PCD63GPⅡb/Ⅲa正常对照组81.01±0.081.00±0.070.99±0.051.00±0.060.66±0.11模型组8 0.34±0.02a 0.36±0.01a 0.43±0.03a 0.17±0.01a 0.47±0.06a蛇伤胶囊组8 0.68±0.03ab 0.66±0.03ab 0.74±0.03ab 0.46±0.02ab 0.56±0.09cd F值347.758377.362412.1021058.3749.289 P值0.0000.0000.0000.0000.001

4 讨论

全球每年约有540万人被毒蛇咬伤，年死亡人数近10万人[5]。毒蛇咬伤具有起病急、进展快、并发症多等特点，如果未能进行有效早期救治，致残率和致死率较高。福建省是毒蛇咬伤高发省份，竹叶青蛇是主要伤人的蛇种之一[6]，血循毒素是其毒液有效成分，其中蛇毒蛋白酶通过直接或间接地作用于血管壁，破坏血管壁的结构，诱导缓激肽、组胺、5-羟色胺等物质的释放，直接破坏毛细血管内皮细胞，阻断血小板聚集而导致出血[7]。血循毒素在抑制血小板的聚集的同时，又促进血小板凝固，并且在促凝过程中消耗大量血小板，引起急性皮下广泛出血[8]，表现为伤口局部肿胀、疼痛、出血，皮肤可见散在血水疱和瘀斑，患肢明显肿痛。

骨髓中巨核细胞质脱落下来的无核细胞就是血小板，其在出血和凝血过程中起重要作用。正常情况下，在循环血液中，血小板以一种非活化的静息状态存在，在各种因素刺激作用下，血小板被活化，发生形态转变，介导血小板黏附、聚集、释放反应[9]。CD41（GPⅡb）、CD61（GPⅢa）归属于细胞黏附受体整合素家族，可与纤维蛋白原、血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）等相结合，发挥促进血小板黏附、聚集等作用[10]。在静止状态的血小板中，CD41和CD61各自分布于血小板膜表面，血小板活化后，二者相结合形成GPⅡb/Ⅲa复合物存在于血小板膜表面，作为一种跨膜的糖蛋白信号受体，其可在质膜上进行双向传递生物信息。“由内向外”的信号转导引起GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原等物质的亲和力增加，并促进“由外向内”的信号放大，在血小板与纤维蛋白原的连接过程中发挥桥梁作用，进而引起血小板功能发生一系列变化，在血小板功能、止血和血栓形成中发挥重要作用[11-12]。研究提示血小板被激活后，GPⅡb/Ⅲa表达水平与出血程度呈负相关，血小板活化反应越弱，出血风险越高[13]。CD62P及CD63均属于血小板的膜糖蛋白，其中CD62P是位于血小板α颗粒内的膜糖蛋白、CD63是血小板溶酶体膜上的颗粒糖蛋白，在未激活的血小板表面很少表达。当血小板被激活后，CD62P、CD63能够随着血小板脱颗粒在血液中大量表达，当其表达过高，则能迅速促进血栓形成，是体现血小板活化情况的重要指标[14-15]。杨家慧等[16]研究分析了CD62P、CD63表达水平与血栓弹力图相关参数的关联，发现CD62P水平与血小板聚集率呈正相关、CD63水平与凝血反应时间R呈负相关。温军祥等[17]研究发现血小板活化因子CD62P、CD63与血小板计数呈负相关，说明血小板活化与血液凝血异常有关。

《普济方·蛇伤》云：“夫蛇，火虫也。热气炎极，为毒至甚”。竹叶青蛇伤以局部红肿热痛为主要表现，属中医毒蛇咬伤火毒证范畴，火毒之邪迫血妄行、耗血动血，腐败肌肤，因此火毒损络是竹叶青蛇伤的主要病机，泻火解毒法是治疗竹叶青蛇伤的基本治法。

临床研究[18-19]发现应用具有泻火解毒作用的蛇伤凉血合剂、黄连解毒汤合犀角地黄汤均可有效抑制竹叶青蛇伤所致的凝血酶时间、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间延长及纤维蛋白减少，增加血小板计数，有效防治竹叶青蛇伤导致的机体凝血功能障碍，缓解患肢肿胀疼痛等症状。蛇伤胶囊由大黄、黄连、山慈菇、杨梅皮、土木香、京大戟、白芷、冰片等药物组成，可直降其火，散脏腑经气之热邪，清解气血的火毒以平热，具有泻火解毒的功效，切合竹叶青蛇伤火毒损络的病变特点，组方用药体现了《黄帝内经》“热者寒之”的正治之法，在临床应用中能够明显缓解患处疼痛与肿胀症状，改善血小板水平，临床应用疗效肯定[20]。本研究结果显示，竹叶青蛇伤模型中血小板细胞CD41、CD61、CD62P、CD63 mRNA表达及GPⅡb/Ⅲa水平显著降低，提示竹叶青蛇伤时血小板活化功能受抑制，蛇伤胶囊可通过提高CD41、CD61、CD62P、CD63、GPⅡb/Ⅲa水平减轻竹叶青蛇伤导致的血小板活化功能抑制，促进血小板活化，减轻叶青蛇伤所致的凝血障碍，蛇伤胶囊调控血小板活化功能具体机制还有待进一步研究。