不同定位标记物应用于超声引导下射频消融肝肿瘤的比较研究

沈宇涵 王 冰 赵 堃 武 昊 王 凇 严 昆 杨 薇

目前超声引导下射频消融已广泛应用于肝肿瘤的治疗，尤其对最大径≤3 cm 的肝细胞癌、肝转移癌具有根治性效果［1-4］。肿瘤较大和边界不清晰是射频消融后早期复发的危险因素［5］，部分患者由于肝炎、肝硬化背景或转移癌灶经化疗、放疗后，二维超声图像上病灶显示不清或边界模糊，导致消融过程中超声难以精准定位肿瘤，常需结合超声造影、CT 或MRI 等影像学检查。由于肿瘤呈浸润性生长，为确保消融范围达到安全边界［6-8］，较大的肿瘤常需进行重叠消融，但首次消融过程中产生的气体在二维超声图像中呈团状强回声，可使残余肿瘤显示不清，导致再次布针时精准定位肿瘤边界更为困难。若能在超声引导下射频消融肝肿瘤时直接于肿瘤边缘微创并便捷地植入显示清晰、持久的定位标记物，则可指导适形消融肿瘤。肿瘤放疗时可在CT或MRI引导下利用基准标记定位肿瘤，具有良好的可行性且严重并发症极少［9-13］，由此推测探寻二维超声可显示的定位标记物并植入肝内，有望实现射频消融术前准确标记肿瘤安全范围，并进一步在消融过程中指导较大肿瘤重叠消融。本实验旨在探讨不同状态材料作为射频消融术中肿瘤位置及安全边界参照的可行性，从而实现直观定位肿瘤、精准指导消融范围以实时引导布针，保障治疗的准确性。

材料与方法

一、标记物材料

本实验纳入24种医用材料作为标记物（表1）。其中气体材料使用空气。固体材料中金属使用22 G 穿刺针芯分别制成长度为1 mm、3 mm、5 mm的短棒状标记物。液体材料中，碘油+碳酸氢钠混合溶液由碘油与碳酸氢钠以2∶1 比例配置；声诺维（SonoVue®，注射用六氟化硫微泡，意大利博莱科公司）每瓶使用5 ml生理盐水配制；声诺维-F127 配置方法为预冷Pluronic F127 温敏凝胶及注射器，注射前每瓶声诺维于冰上使用5 ml溶液相Pluronic F127溶解；无水乙醇+透明质酸钠混合溶液由无水乙醇与透明质酸钠溶液以2∶1比例配置。

表1 24种不同状态标记物材料

二、实验仪器、对象及方法

1.仪器：体外实验的超声引导使用GE Logiq E9彩色多普勒超声诊断仪，9L线阵探头，频率2～8 MHz；动物实验的超声引导使用飞依诺VINNO 8便携式彩色多普勒超声诊断仪，X4-12L 线阵探头，频率4～12 MHz。射频消融使用LDRFT-50 射频治疗仪（绵阳立德电子技术有限公司），体外实验使用RFDJ-03 单针电极；动物实验使用RFDJ-01单针电极。

2.体外实验：将新鲜离体牛肝置于贴附负极电极片的容器中，应用二维超声扫查全肝，选取无裂隙或韧带处并于超声引导下穿刺进针，深度约3～5 cm。其中固体标记物使用20 G 穿刺针穿刺植入，大小适于穿刺针内径；气体、液体标记物使用2 ml 注射器连接已除去针芯的20 G穿刺针注射植入，注射量0.2 ml，根据预实验结果，本实验采用中等、匀速推注气体、液体标记物。然后连接射频治疗仪，电极针尖长度设置为1 cm，于超声引导下避开肝脏大血管穿刺，依次以消融电极针距标记物垂直距离1.0 cm、0.5 cm 及消融电极针紧贴标记物由远及近进行单电极针消融。设置参数为定时模式，输出功率45 W，消融时间2 min。超声引导及穿刺过程均由同一操作者完成，每种材料植入及消融时尽量保证入针角度一致。

3.动物实验：选取8 只健康雌性比格犬，体质量13～16 kg［北京芳元缘养殖场，许可证号：SCXK（京）2020-0001］，本实验获得机构动物护理和使用委员会的批准。比格犬射频消融前禁食12 h，肌肉注射盐酸氯胺酮（20 mg/kg，西南药业股份有限公司）麻醉充分后将犬左侧卧位放置于操作台上固定，对右侧腹部及后肢剃毛，将电极板贴附于右后肢皮肤上。消毒右侧腹部皮肤，超声引导下经皮穿刺于肝内植入标记物，30 min 后采用单针经皮穿刺插入消融电极针，于针尖距标记物垂直距离1 cm 处进行消融，设置消融参数为直径模式1 cm。

三、观察内容

1.标记物的超声可视性及持久性：①超声可视性通过观察二维超声图像中标记物植入肝内后回声强度、与周围肝实质对比度、边缘是否清晰进行评价，本实验将标记物与周围肝实质对比明显且边界清晰判为超声可视性良好。②持久性通过观察标记物在植入原位的形状、回声强度、范围随时间的变化情况进行评价，空气及固体标记物均能够在植入原位保存1 h以上、液体标记物能够在植入原位保存10 min 以上即为持久性良好。

2.体外实验中观察射频热场对标记物的影响：分别于射频消融后即刻及20 min 后观察标记物形状、范围、回声强度变化，以及标记物与射频强回声区的位置关系、可否快速辨认标记物位置。

3.动物实验观察射频热场对标记物的影响并评估其安全性：分别于标记物植入即刻、5 min、30 min 观察其位置是否随呼吸移动及其在体内回声变化。观察实验犬肝血流灌注和射频热场对标记物持久性的影响；射频消融后观察实验犬并发症发生情况，于消融后第7 天复查超声观察实验犬肝内标记物及肝组织情况；然后处死实验犬，以与针道平行的切面多断面剖开犬肝，评估标记物与消融灶的关系及肝组织损伤情况。

结果

一、体外实验评估标记物的超声可视性及持久性

1.超声可视性：①空气在二维超声图像中呈椭圆形强回声，超声可视性良好。②固体标记物中，吸收性明胶海绵、碳酸氢钠、金属、聚乙醇酸（PGA）可吸收手术缝线在二维超声图像中均呈强回声，边缘清晰，形状规则，超声可视性均良好，且不同长度金属的成像效果不同，3 mm、5 mm 金属较1 mm 金属的彗星尾征更明显；塑料在二维超声图像中未见显示。③液体标记物中，海藻酸钙、50%高渗葡萄糖、聚桂醇、PEG400、无水乙醇在二维超声图像中均呈类圆形或片状偏强回声；声诺维及声诺维-F127 在二维超声图像中均呈强回声，且后者形状更规则，不易随探头加压流动；超声耦合剂在二维超声图像中呈边界清晰的低或无回声，以上标记物超声可视性均良好；还原型谷胱甘肽溶液二维超声图像中未见显示；其余液体标记物与肝实质回声差异较小或回声不均匀，边界不清晰，形状不规则，超声可视性较差。见图1。

图1 不同材料标记物植入离体牛肝即刻二维超声图

2.持久性：空气及固体标记物中的吸收性明胶海绵、PGA 可吸收手术缝线、5 mm 金属均能在植入原位保存1 h 以上，持久性均良好。液体标记物中，声诺维-F127、海藻酸钙、超声耦合剂、聚桂醇静置10 min后变化不明显，持久性均良好；碳酸氢钠、50%高渗葡萄糖、碘油+碳酸氢钠溶液、基质胶、无水乙醇、PEG400及卡波姆940 虽可见显影，但标记范围缩小，形状变化较大；其余液体标记物静置10 min 后二维超声图像中显影不明显，不易快速辨认。

二、体外实验中射频热场对标记物的影响

根据离体牛肝实验结果，选择超声可视性及持久性均良好的标记物（空气、吸收性明胶海绵、PGA 可吸收手术缝线、5 mm金属、声诺维-F127、海藻酸钙、超声耦合剂、聚桂醇）进行射频消融。结果显示，5 mm金属、海藻酸钙在消融后即刻及20 min后均仍可见彗星尾征或后方回声衰减，可与消融区气体的强回声区分（图2）；其余标记物在消融电极针垂直距离距其1.0 cm、0.5 cm 消融时可见，在消融电极针紧贴标记物消融时被团状强回声覆盖，二维超声图像中不能辨别标记物位置。

图2 不同材料标记物植入离体牛肝射频消融后二维超声图

三、动物实验评估标记物的超声可视性及持久性

经体外实验筛选并考虑到材料的安全性，于实验犬肝内植入空气、PGA可吸收手术缝线、5 mm金属、超声耦合剂4种标记物。各标记物超声表现与体外实验一致，其中空气、PGA可吸收手术缝线、5 mm金属均呈强回声，超声耦合剂呈低回声。标记物随呼吸时肝脏的移动而相对肝外结构移动，但在肝内的相对位置保持不变。4 种标记物在植入5 min 及30 min 时，其形状、回声强度与植入后即刻比较无明显变化。实验犬肝血流灌注、呼吸均未对标记物植入过程及超声成像产生明显影响，各标记物的超声可视性及持久性均良好。见图3。

图3 不同材料标记物植入实验犬肝即刻、5 min、30 min二维超声图

四、动物实验中射频热场对标记物的影响及其安全性评估

1.射频热场对标记物的影响：消融后即刻二维超声示实验犬肝内空气、PGA 可吸收手术缝线、5 mm 金属、超声耦合剂均可见，消融灶直径为（1.13±0.06）cm，标记物距消融电极针约0.5 cm。消融后第7 天二维超声示5 mm 金属仍清晰显示，周围肝组织无明显改变；植入PGA 可吸收手术缝线处回声增强且范围较前扩大；植入空气、超声耦合剂处均未见显影。见图4。

图4 不同材料标记物植入实验犬肝射频消融后即刻、第7天二维超声图

2.标记物的安全性：4 种标记物穿刺植入过程中实验犬呼吸、心跳平稳，消融后7 d 内均未发生出血、感染等并发症，超声检查均未见肝前区出血及大血管损伤。消融第7 天处死实验犬，犬肝大体标本示5 mm金属肉眼可见，PGA 可吸收手术缝线肉眼未能确认标记位置；病理组织学检查示标记物植入处周围未见炎症、出血等肝组织损伤性反应。见图5。

图5 实验犬肝消融灶切面大体图及肝组织病理图

讨 论

超声引导下射频消融肝肿瘤具有微创、安全、有效的优势，目前在临床的应用逐渐广泛。肝肿瘤进行射频消融时，消融不完全的肿瘤可通过自噬逃逸［14］、上皮间充质转化［15］、增加肿瘤细胞干性［16］等多种机制促进其在肝内局部或全身复发转移［17-19］，因此进行根治性治疗时需达到完全消融，这要求对肿瘤精确定位并保证消融安全范围充分，避免因消融布针偏移导致不完全消融，尤其是对体积较大、边界不清晰、形态不规则的肝肿瘤更需确保消融区完全覆盖肿瘤［20］。放疗中使用的基准标记在影像学检查时可保持数月内清晰显像且位置稳定，已有学者［21-22］尝试在CT引导下于肝肿瘤边缘植入线圈或金标等市售基准标记，并对化疗后消失的肝转移瘤进行随访。近年来研究［23-25］证实液体标记物较金属标记物可减少成像产生的伪影，并提高患者接受度，但尚无研究探讨在超声检查中使用基准标记定位肿瘤的可行性。本实验探索性分析了24种医用材料的超声可视性及持久性，旨在寻找价廉、植入简单、获取便利的标记物，以实现超声引导下射频消融术中精准标记肿瘤安全边界，从而指导消融范围及布针。

本实验结果显示，在标记物植入的便捷程度方面，固体材料中吸收性明胶海绵、碳酸氢钠难以进入穿刺针内；液体材料中超声耦合剂成分为高分子聚合物水凝胶，透声性、稳定性及可注射性均较好，是超声定位的理想标记物，动物实验也表明其在消融后即刻的超声可视性尚可，但其成分复杂尚不能直接应用于人体，后续充分验证耦合剂成分安全性后有望作为肝内标记物。同时，本实验通过探索其他单一成分凝胶类材料发现，基质胶和甲基纤维素黏度较大，抽吸时易混入气泡且注射阻力较大，导致完成单处标记耗时长，形成的标记回声不均；新型材料中海藻酸钙安全、无毒且成本相对低，多作为促进伤口愈合的可生物降解材料［26-27］，植入离体牛肝内后超声成像效果稳定，且不易受消融热场的影响；Pluronic F127 温敏凝胶的特性为低温时为可注射溶液，20℃～30℃时转变为凝胶，黏度增大，且该过程可逆，本实验结果发现凝胶态Pluronic F127对造影剂微泡的原位固定性能优于生理盐水，但目前海藻酸钙和Pluronic F127仅用于皮下、肌肉等局部递送给药，需进一步验证其在肝组织内注射的安全性［28］。体外实验和动物实验结果均表明，5 mm金属在二维超声图像中可见彗星尾征，与周围组织较易辨别，且超声可视化效果不受消融热场的影响，可作为肿瘤边界的长期理想标记物，但由于植入后无法取出，可能存在着潜在的医源性损伤问题，有待进一步探究价廉且更安全的金属标记物。PGA 可吸收手术缝线的超声可视性良好，较液体材料形状固定，且动物实验发现消融后第7 天标记处回声增强、范围稍增大，可能为组织吸收引起的局部机化所致，可进一步深入探究液-固相变可吸收性聚合物材料作为标记物。此外，本实验将空气注射植入离体牛肝和实验犬肝作为定位标记物，二维超声示其呈团状强回声，易与肝内结构区分并稳定持续显影，射频消融后即消散，引起排斥反应的可能性较低，通过改进注射方法并控制标记物形状一致性，有望作为肝肿瘤射频消融术的超声定位标记物。

本实验中离体牛肝射频消融结果显示，当标记物距消融电极针垂直距离为0.5 cm 及以上时，二维超声图像中可清晰显示其回声；当标记物紧贴消融电极针尖时，消融后即刻因被团状强回声覆盖，二维超声图像中不能准确定位。提示于肿瘤边界外0.5 cm处进行标记，射频消融后标记物消失则表明消融灶边界达到安全范围。此外，较大的肿瘤单次布针可导致消融不完全，此时可利用标记物指导重叠消融布针，即先于距肿瘤边界1.0 cm 处进行标记，首次布针消融后参照标记物再次布针，通过测量消融区边界距标记物的距离可以评估消融安全范围是否充分。近年来，多模态影像融合技术及导航系统逐渐应用于肝肿瘤的定位［29-31］，其通过融合CT或MRI图像指导超声引导下介入治疗，但目前临床工作中消融肝肿瘤时受肝脏硬度、患者体位变化、呼吸幅度及麻醉深度的影响，多模态影像融合技术仍有一定的融合定位误差，且图像质量受图像配准技术的影响，需进行多次CT或MRI检查及较长时间的图像处理，在图像对位以保证融合准确度时操作复杂且耗时较长。根据本实验结果推测，与超声造影、多模态影像融合技术及体表定位标记相比，肝内标记更加简便、直接、可实时显示，不仅有助于辨别肿瘤位置，还方便比对消融后消融灶边界在指定径线上是否达到安全范围，标记点位及数量亦可根据肿瘤位置灵活选择，更有助于指导临床适形消融肝肿瘤。

本实验的局限性：①虽然体外实验中探索了24种医用材料，但仍未全面覆盖潜在可用的材料，今后仍需进一步积累；②动物实验中犬肝病理检查时并未发现二维超声图像显示的PGA 可吸收手术缝线及5 mm金属标记处，需进一步优化病理取材方法，根据临床实际操作情况进行精确的模拟以提供详细数据。

综上所述，本实验探索了超声可视化定位标记物的材料选择，发现空气在二维超声图像中显示清晰且持久，材料容易获取，控制注射速度及注射量等有望作为临床应用的定位标记物，以指导适形消融肝肿瘤；超声耦合剂和声诺维-F127 在二维超声图像中与肝实质回声差异明显，作为肝内标记物可能成为其临床新用途；金属在消融后能稳定保留，可作为肝肿瘤长期定位的理想标记，为临床精准定位肿瘤及指导射频消融布针提供指导。