玉屏风散对肺气虚型变应性鼻炎豚鼠模型IL-4、IL-12、TNF-γ表达水平及鼻腔黏病理变化的影响

宾骥 朱镇华 杨伟丽

本文引用： 賓  骥， 朱镇华， 杨伟丽.玉屏风散对肺气虚型变应性鼻炎豚鼠模型IL-4、IL-12、TNF-γ表达水平及鼻腔黏病理变化的影响[J]. 湖南中医药大学学报， 2024， 44（4）： 545-550.

〔摘要〕 目的 探讨玉屏风散对肺气虚型变应性鼻炎（allergic rhinitis， AR）豚鼠的作用机制。方法 将40只健康杂色英国种豚鼠，随机分为空白组、模型组、玉屏风组、氯雷他定组。除空白组外，其余各组均以鸡卵清蛋白（ovalbumin， OVA）与烟熏法建立肺气虚型AR模型。造模成功后，玉屏风组、氯雷他定组分别予玉屏风散[4.52 g/（kg·d）]、氯雷他定片（0.903 mg/kg）灌胃，空白组及模型组予等体积生理盐水灌胃，处理15 d后，取各组豚鼠血清及鼻腔黏膜。经HE染色法观察鼻腔黏膜细胞形态，ELISA与免疫组化法检测豚鼠血清中白细胞介素-4（interleukin-4， IL-4）、白细胞介素-12（interleukin-12， IL-12）、γ干扰素（interferon-γ， IFN-γ）等细胞因子表达水平。结果 HE染色发现，模型组细胞形态结构明显紊乱，玉屏风组、氯雷他定组细胞形态结构异常状态相对减轻。ELISA结果显示，与空白组比较，模型组、玉屏风组、氯雷他定组豚鼠血清中IL-4、IL-12表达水平升高（P<0.05），IFN-γ表达水平降低（P<0.05）;与模型组比较，玉屏风组、氯雷他定组豚鼠血清IL-4与IL-12含量降低（P<0.05），氯雷他定组IFN-γ表达水平升高（P<0.05）。免疫组化染色显示，与空白组比较，模型组豚鼠鼻腔黏膜IL-4、IL-12表达明显降低（P<0.05），IFN-γ表达明显升高（P<0.01）;与模型组比较，玉屏风组与氯雷他定组IL-4表达明显降低（P<0.05），氯雷他定组IL-12表达明显降低（P<0.05）。结论 玉屏风散可能通过影响IL-4、IL-12、IFN-γ水平，改变鼻腔黏膜细胞形态治疗肺气虚型AR。

〔关键词〕 玉屏风散;变应性鼻炎;肺气虚型;鼻腔黏膜细胞形态;白细胞介素

〔中图分类号〕R285.5         〔文献标志码〕A          〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.003

Effects of Yupingfeng Powder on expression levels of IL-4， IL-12， and TNF-γ as well as nasal mucosa pathological changes in guinea pig model of allergic rhinitis with lung qi deficiency pattern

BIN Ji， ZHU Zhenhua*， YANG Weili*

The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To explore the action of mechanism of Yupingfeng Powder （YPFP） on allergic rhinitis （AR） with lung qi deficiency pattern in guinea pigs. Methods Forty healthy variegated British guinea pigs were randomized into blank group， model group， YPFP group， and loratadine group. Except for the blank group， the AR models with lung qi deficiency pattern were established in the other groups using ovalbumin （OVA） and smoke exposure. After successful modeling， the YPFP group and the loratadine group were treated with YPFP [4.52 g/（kg·d）] and loratadine tablets （0.903 mg/kg） by gavage， respectively， while the blank group and model group were given an equal volume of normal saline by gavage. After 15 days of treatment， the serum and nasal mucosa samples of guinea pigs were collected from each group. The morphology of nasal mucosa cells were observed using HE staining， and the expression levels of cytokines such as interleukin-4 （IL-4）， interleukin-12 （IL-12）， and interferon-γ （IFN-γ） in the serum of guinea pigs were measured by ELISA and immunohistochemical staining. Results HE staining showed that the model group exhibited significant morphological and structural disorders， while the morphological and structural abnormalities were relatively alleviated in the YPFP group and the loratadine group. ELISA results indicated that compared with the blank group， the expression levels of IL-4 and IL-12 in the serum of guinea pigs in the model group， YPFP group， and loratadine group increased （P<0.05）， while the expression level of IFN-γ decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the serum levels of IL-4 and IL-12 in the YPFP group and loratadine group decreased （P<0.05）， while the expression level of IFN-γ in the loratadine group increased （P<0.05）. Immunohistochemical staining revealed that compared with the blank group， the expressions of IL-4 and IL-12 in the nasal mucosa of guinea pigs in the model group were significantly lower （P<0.05）， while the expression of IFN-γ was significantly higher （P<0.01）. Compared with the model group， the IL-4 expression decreased significantly in both the YPFP group and loratadine group （P<0.05）， and the IL-12 expression in the loratadine group decreased significantly （P<0.05）. Conclusion YPFP may treat allergic rhinitis with lung qi deficiency pattern by influencing the levels of IL-4， IL-12， and IFN-γ， and changing the morphology of nasal mucosa cells.

〔Keywords〕 Yupingfeng Powder; allergic rhinitis; lung qi deficiency pattern; morphology of nasal mucosa cells; interleukin

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR），也称过敏性鼻炎，是耳鼻咽喉科常见的上呼吸道变应性疾病[1]。临床上常表现为阵发性喷嚏、大量鼻涕、鼻塞、鼻痒等症状，具有病程长、迁延不愈、反复发作的特点，严重影响患者健康及生活质量[2]。目前，AR西医治疗有6类主要药物，分别是糖皮质激素、H1受体拮抗剂、抗白三烯药、减充血剂、抗胆碱药、肥大细胞膜稳定剂[3]。虽然现有药物品种繁多，但不良反应明显，效果维持时间短，容易产生耐药性。特异性免疫治疗亦称脱敏治疗，对花粉、尘螨诱发的间歇性过敏性鼻炎的疗效比较肯定，但治疗时间长导致依从性较差，治疗费用昂贵，同时有可能引发严重的不良反应。免疫治疗是近年来过敏性疾病的研究热点之一，但学术界对其远期疗效仍有争议[4]。手术治疗疗效肯定，但易复发，且部分患者留有咽干、口干等不良反应[5]。因此，寻找更安全有效的疗法是AR治疗中亟待解决的问题。

中医中药在治疗变应性鼻炎中具有独特优势，AR在中医学中又名“鼻鼽”，中医病机多为脏腑虚损，卫表不固。肺气虚型AR以肺气虚损为主要病机，肺主气，生卫气，行气周身，调控凑理，肺气虚则腠理疏松，风寒邪气均易乘虚侵袭而致肺失通条，肺失宣降，水行不畅，津液壅塞鼻窍而发病。临床表现为鼻痒，喷嚏，鼻塞，嗅觉减退，畏风怕冷，自汗，少气懒言，舌淡胖，脉濡弱;查体可见鼻甲苍白水肿。治则益气固表、温肺散寒;方以玉屏风散加减[6]。基于此，本研究以OVA与烟熏法构建肺气虚型AR豚鼠模型，经玉屏风与氯雷他定干预，通过比较豚鼠血清与黏膜中IL-4、IL-12、IFN-γ的表达水平，确定玉屏风散对肺气虚型AR的治疗效果，以期为开发更有效的AR治疗药物提供新参考。

1 材料与方法

1.1  实验动物

英国种杂色豚鼠（雄性）40只，体质量250～300 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，许可证书：SCXK（湘）2020-0005，饲养于湖南中医药大学动物中心实验室。饲养在湿度42%～65%、温度19～25 ℃的环境下，常规标准饲料喂養，自由饮水，昼夜交替循环照明，适应性喂养1周后进行实验。本实验经过湖南中医药大学动物伦理委员会批准（备案编号LLBH-202007020001），符合实验动物福利伦理原则。

1.2  实验药物

玉屏风散方组成：黄芪、白术各20 g，防风10 g。中药饮片由湖南省中医药大学第一附属医院中药房提供。经湖南中医药大学第一附属医院鉴定为正品，煎煮方法为适量清水没过药材1 cm浸泡30 min后武火将药液煮开，文火保持沸腾20 min，留取药液。

氯雷他定片（拜耳医药上海有限公司，批号：JS08187，国药准字号：H10970410，规格：10 mg/粒）。

1.3  主要试剂

鸡卵清蛋白、曲拉通X-100（Solarbio公司，批号：A8041、T8200）;氢氧化铝（Thermo Fisher公司，批号：PF201964）;豚鼠IFN-γ、IL-4、IL-12ELISA试剂盒（江苏菲亚生物科技有限公司，批号：FY3705-A、FY3692-A、FY3718-A）;乌拉坦（Sigma公司，批号：MF-CD00007966）;苏木素-伊红染液、柠檬酸修复液（皮诺飞生物公司，批号：P0064、P0026）;INF-γ抗体（Servicebio公司，批号：AC221121093）;IL-4抗体、IL-12抗体（艾方生物，批号：20220824、20220517），HRP标记山羊抗兔二抗（Abbkine公司，批号：A21020）;氨水（国药集团化学试剂有限公司，批号：10002108）。

1.4  主要仪器

Tianshi98型洗板机（北京拓普分析仪器有限责任公司）;Rayto RT-6100型酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）;TG16W型微量高速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）;TGL16M型台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）;HT-111B型恒温摇床（上海赫田科学仪器有限公司）;AE1204型电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）;XB220A型瑞士PRECISA电子分析天平（深圳市朗普电子科技有限公司）;81-2型恒温磁力搅拌器（北京世纪科信科学仪器有限公司）。

1.5  动物分组与造模

1.5.1  动物分组  根据随机数字表法将40只豚鼠分为空白组、模型组、玉屏风散组、氯雷他定组，每组10只。经过7 d适应性喂养后造模。

1.5.2  AR造模方法  模型组、玉屏风散组、氯雷他定组按卵蛋白致敏法[7]制备AR动物模型。具体步骤如下：按每只豚鼠卵蛋白0.3 mg、氢氧化铝粉末30 mg，加生理盐水至1 mL配成混悬液，隔日腹腔注射1次，共注射7次;配制0.25%卵蛋白生理盐水溶液，按每只豚鼠2 mL行雾化吸入，每日1次，连续5 d;间歇1周后，以1%卵蛋白生理盐水溶液滴鼻（40 μL/鼻孔/次）进行鼻腔激发，每日1次，7 d后，观察大鼠喷嚏次数、抓鼻次数和流涕情况，判定AR造模是否成功。

1.5.3  肺气虚型造模方法  AR造模成功后，模型组、玉屏风散组、氯雷他定组参照陈小野的烟熏法[8]，经改良后建立实验动物肺气虚证模型。具体步骤为：特制玻璃烟熏造模箱（体积60 cm×40 cm×40 cm），特制烟熏艾条长120 mm（内含硫磺粉7 g、艾绒30 g）。将实验豚放入烟熏箱，点燃艾条，烟熏30 min，每日2次，连续熏烟15 d。根据《实用中医证候动物模型学》中相关内容[9]，筛选记录可观察到的6项动物症状表现：（1）咳嗽;（2）气短喘促;（3）痰白清稀（口鼻四周分泌物）;（4）恶风畏寒（蜷足局抱团）;（5）神疲乏力（反应迟钝，活动减少）;（6）毛发枯槁无光泽。采用赵秀杰等的症状评分标准[9]，激发后即刻至30 min观察动物搔鼻、喷嚏、鼻溢液症状，采用叠加量化记分，行为学总分>5分表示造模成功。

1.5.4  给药方法  给药方法按临床用药，以人体质量60 kg为标准，按照体表面积-剂量换算法计算给药剂量灌胃[10]。根据豚鼠每日剂量及每千克质量灌胃所能耐受的容量体积配制药物浓度，玉屏风散给药剂量为4.52 g/（kg·d），氯雷他定片给药剂量为0.903 mg/kg。空白组与模型组给予等量的生理盐水溶液，每日分2次灌胃给药，连续处理15 d。

1.5.5  观察指标及评价标准  最后一次灌胃处理1 h后，使用戊巴比妥钠溶液（40 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，采集实验用标本。

（1）采集血清：麻醉后将豚鼠一侧颈静脉穿刺，普通干管收集豚鼠新鲜血液2 mL，室温下静置1 h后离心（3 500 r/min，10 min），将所得上清液（血清）转移至Eppendorf管，-20 ℃保存备用。

（2）鼻黏膜标本的采集：经颈静脉抽血完备后，使用耳科杯状咬钳咬取部分鼻腔黏膜，生理盐水清洗后，平铺于硬纸片上放入10%甲醛中固定，以待后续实验使用。

1.6  指标检测

1.6.1  ELISA检测血清中炎性因子水平  按照IL-4、IL-12、IFN-γ ELISA试剂盒说明书，经加抗原包被4 ℃过夜后，加入待检血清，37 ℃孵育2 h后清洗，加入酶标抗体，37 ℃ 孵育2 h后再次清洗，加入底物液37 ℃孵育30 min后，加终止液，于450 nm波长测定吸光度值，通过标准曲线计算样品中相关因子含量。

1.6.2  HE染色观察豚鼠鼻黏膜形态  使用10%中性缓冲液福尔马林对鼻黏膜组织进行固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋后切片（厚约3 μm），经60 ℃烤片2 h、二甲苯与梯度乙醇脱蜡后，进行HE 染色。染色步骤为：苏木精染色2 min，冲洗，1%盐酸乙醇分化液10 s，冲洗，氨水返蓝2 min，梯度乙醇脱水，伊红染色2 min，冲洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明。经中性树胶封闭后，于镜下观察鼻黏膜组织细胞形态。

1.6.3  免疫组化检测豚鼠鼻黏膜  脱蜡后将玻片置于高压锅中，使用1×柠檬酸（pH 6.0）修复液进行抗原修复，经组化笔圈定检测组织范围后，依次使用过氧化物酶阻断剂阻断30 min，10%山羊血清封闭30 min，孵育相应一抗过夜，孵育二抗30 min，DAB显色1 min，复染苏木素2 min，1%盐酸乙醇分化液分化10 s、氨水返蓝2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。经中性树胶封闭后，于镜下观察并获取图像。

1.7  统计学方法

计量资料采用“x±s”表示，多组样本均数满足方差齐性者用F检验，两组之间比较采用q检验，否则用轶和检验。应用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1  HE染色观察豚鼠鼻黏膜形态差异

空白组黏膜层上皮细胞排列规则紧密，结构清晰，黏膜下层细胞结构清晰，间隔正常;模型组黏膜层上皮细胞可见部分萎缩，细胞结构异常，黏膜下层细胞部分融合，结构紊乱;玉屏风散组细胞结构可见恢复，部分黏膜层上皮细胞排列相对正常，但较空白组仍有部分紊乱;氯雷他定组较造模前细胞形态部分恢复，细胞结构仍较紊乱。详见图1。

2.2  ELISA法检测豚鼠血清中 IL-4、IL-12、IFN-γ含量

与空白组比较，模型组IL-4、IL-12表达升高，IFN-γ表达降低（P<0.05）;与模型组比较，玉屏风散组及氯雷他定组血清IL-4与IL-12含量降低，氯雷他定组IFN-γ含量升高（P<0.05），玉屏风散组IFN-γ虽有升高但不具有统计学差异（P>0.05）;与氯雷他定组比较，玉屏风散组IL-4、IL-12、IFN-γ含量基本相当。详见表1。

2.3  免疫组化法检测豚鼠鼻腔黏膜中IL-4、IL-12、IFN-γ表达水平

与空白组比较，模型组黏膜层上皮细胞IL-4、IL-12棕染加深，表达上调，IFN-γ棕染減轻，表达下调（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，玉屏风散组及氯雷他定组IL-4棕染减轻，表达下调（P<0.05）;氯雷他定组IL-12棕染减轻，表达下调（P<0.05）;玉屏风散组虽见IL-12棕染减轻，但与模型组比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。详见图2。

3 讨论

AR属于Ⅰ型变态反应，其病理生理过程分为速发相反应和迟发相反应。在接触变应原后5～10 min，肥大细胞释放炎性介质，导致出现打喷嚏、流清涕、鼻塞和鼻痒等速发相典型反应;在4～6 h后可表现为以鼻塞为主的迟发相反应[11]。从免疫学角度来看，AR是体外环境因素作用于机体免疫系统，导致Th1/Th2免疫反应失衡，以鼻腔黏膜Th2细胞免疫反应为主的变应性炎症反应，其主要的免疫病理学特征是组织中大量表达Th2细胞因子的细胞浸润[12-13]。当机体受到异常抗原刺激时，Th1/Th2细胞间的动态平衡被破坏，Th2类细胞因子会过度表达，Th1类细胞因子表达减少，进而细胞免疫反应增强，从而导致AR等过敏性疾病的发生[14]。其中，Th2细胞主要释放IL-4、IL-12，二者是AR发生过程中最重要的细胞因子，可通过刺激B细胞促进IgE的合成，激活中性粒细胞和巨噬细胞的协调影响IgE分泌，加强Th2的促炎症功能，导致变态反应炎症发生[15]。IFN-γ为Th1细胞的标志性细胞因子，和IL-4一样也是B细胞合成IgE的调节因子之一，能抑制Th2细胞的活性， 抑制IL-4的产生[16]。

鼻鼽的发生与肺脾肾三脏关系密切，自古医家就有虚实两类区分。一类为脾胃实热，其中以《黄帝内经》《素问玄机原病式·六气为病》《奇效良方》为代表，其代表理论总结为热犯阳明，发于鼻而为痒，主要临床表现以鼻痒、流浊涕并见咳嗽、鼻衄、呕逆等症状为主[17-18]。另一类则为肺脾气虚，《诸病源候论》《辨证录》《医法圆通》等著作阐述其肺肾本元虚弱、虚寒内生，犯于鼻窍而为清涕，而此类证型不常见其他兼证[19]。还有部分认为鼻鼽由素体气虚，卫表不固，复感风寒发病，其虚实证候夹杂，临床表现相对复杂[20]。

肺为相傅之官，主气行水。肺脾相合可生卫气，行卫气于周身，调控凑理，防御外邪;肺肾相合可通水道，行水气于三焦，化生阴精，滋养周身。若肺气虚损，卫气难以化生，则腠理疏松，津液不得推动，则水饮停聚。鼻为头面清阳之窍，凑理为遍布周身之窍，此两者均为阳气所布之处。《黄帝内经》言：阳化气，阴成形。肺为气之主，肺气一虚，阳气不达，则外在阴寒邪气与内生阴邪客于清窍，此均易乘虚侵袭而致肺失通条，一旦肺失宣降，水行不畅，则更加重内在肺气虚损。因而，以肺气虚这一证型切入AR的论治与药物研究是可行之策。现有研究也发现，使用相关药物与疗法针对肺气虚证进行治疗可有效缓解AR症状与相关因子表达[21-22]。

玉屏风散出自元代朱丹溪的《丹溪心法》，组方精炼，特色明确，具有益气固表、扶正祛邪之功效，常用于治疗鼻鼽、咳嗽等疾病的肺气虚证型[23]。《本草备要》言：黄芪，补气，固表;白术，健脾燥湿，甘补脾，温和中;防风，宣，发表，胜湿。方中黄芪为君，益气固表，白术为臣，健脾益气，防风佐使，走表散邪，三药合用，补气并益肺，扶正兼祛邪。气虚得芪则健，水停得术则化，气健水化再得防风之助，则宣降复归于常，表不留邪，三药合用补中寓疏、散中寓补[24]。现代药理学研究证实，黄芪主要成分为黄芪多糖，其具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血糖、调整血压等一系列作用[25-26]，而针对鼻鼽其具有抗炎及对机体免疫功能的双向调节作用为其治疗基础[27]。白术主要作用成分可提高巨噬细胞的活性，增强机体非特异性免疫功能[28]。而防风水煎液有抗Ⅰ型变态反应的作用[29-30]。

在本研究中，使用了OVA与烟熏法建立肺气虚型AR模型，经玉屏风散与氯雷他定处理后取材检测。HE染色结果显示，玉屏风散能够明显降低肺气虚型AR豚鼠鼻黏膜水肿程度，减轻鼻黏膜炎性细胞浸润，且其效果较氯雷他定更为明显。同时ELISA结果显示，经玉屏风散与氯雷他定处理后可降低豚鼠IL-4、IL-12表达水平，升高IFN-γ表达水平，说明玉屏风散可影响IL-4、IL-12、IFN-γ表达水平，对肺气虚型AR产生治疗作用，其对IL-4与IFN-γ作用与氯雷他定处理相当，提示玉屏风散在治疗肺气虚型AR上的强力作用。另外，本研究经免疫组化法检测到玉屏风散与氯雷他定处理可明显降低IL-4表达水平，但玉屏风散对IL-12与IFN-γ的影响不够明显，提示玉屏风散对其的作用可能不只是简单的抑制与促进表达作用，可能涉及更复杂的内在机制，这也是日后值得研究的方向。

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