尼帕病毒TaqMan 探针荧光定量PCR 检测方法建立

孙 彤，孙竹筠，刘静宜，王培培，苏 苌，陈鸿军

（中国农业科学院上海兽医研究所 兽药评价中心，上海 200241）

尼帕病毒（Nipah virus, NiV）为副粘病毒科，亨尼病毒属，具有宿主范围广、致死率高的特点，尼帕病毒病（Nipah virus disease, NVD）为人畜共患的自然疫源性疾病，于1998年首次在马来西亚被发现，随后在新加坡、马来西亚、印度等国家暴发[1]，给养猪业造成巨大经济损失，为公共卫生带来巨大威胁。2018年世界卫生组织将NVD列为对公共卫生造成严重威胁的有限疾病名单[2]。目前全球暴发的NiV感染来源于同一病毒株，该毒株在传播过程中由于遗传变异进化出马来西亚株（NiV-M）和孟加拉株（NiV-BD）[3]。人感染NiV可发生严重神经性脑炎或呼吸系统疾病，死亡率高达到40%～70%。猪感染NiV后表现为呼吸急促，发展为呼吸困难并伴随非自主性咳嗽[4]，死亡率在5%左右[5]。

研究表明，NiV的传播能跨越物种障碍，可通过病毒溢出的方式感染人和其他哺乳动物。果蝠（Fruit bats）为NiV的天然宿主，是引起人和猪NiV感染的主要媒介生物[6]。曾在马来西亚、新加坡暴发的NiV感染，主要为猪场工作人员和屠宰场工人，因此猪是该病毒传播途径中重要的中间宿主：猪捡食果蝠吃剩的带毒果实感染，人接触猪后感染NiV患病，另外猪场建在果蝠栖息地边缘也可直接导致病毒传入猪群[7]。除此之外，野生动物也可通过某种途径将NiV直接传染给人[8]。目前中国还未发现NiV感染和流行的相关报道，但果蝠在云南地区活动频繁，携带大量病毒，其中包括2018年在广东暴发的猪急性腹泻综合征冠状病毒，该病毒与NiV的传播途径具有相似性[3]。中国作为养猪大国，工作人员极易通过密切接触NVD病猪引起感染，但目前仍没有针对NiV的有效预防和治疗措施，因此，需建立完善的NiV监控及检测手段，防范NiV的感染和传播。

NiV与猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪伪狂犬等病毒引起的症状相似，临床上难以区分，实验室检测是最有效的监控方法[10]。NiV属于第一类病原微生物，需在生物安全四级实验室（BSL-4）进行分离培养，一般实验室不具备处理条件。qPCR无需活病毒样本，可在BSL-2实验室进行，不易发生生物安全事故，且准确度、敏感性、特异性高，耗时短，适用于样本中NiV的快速检测及鉴定。本研究建立了针对NiVN基因的TaqMan qPCR检测技术，特异性敏感性高，稳定性好，能为NiV的临床诊断提供快速、灵敏、特异的检测方法，有效监控猪群，防止感染的发生。

1 材料和方法

1.1 核酸、病毒和质粒 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）基因组DNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、猪瘟病毒（Swine fever virus,CSFV）、猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus, PRV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）由中国农业科学院上海兽医研究所保存；含N基因序列（GenBank登录号为：AJ627196.1）的重组质粒pUC57-NiVN（4299 bp），由生工生物工程（上海）有限公司合成；AceQ U+Probe Master Mi、DL2000 Marker、T7 High Yield RNA Transcription Kit、Hiscript Ⅱ U+One Step qRTPCR kit购自南京诺唯赞公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.2 引物及探针 根据保守区设计引物和探针；扩增的目的片段为132 bp；探针5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团；含T7启动子的引物，目的片段为784 bp。引物和探针由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

表1 引物和探针序列Table 1 Sequence of primers and probe

1.5 反应体系的建立与优化 采用AceQ U+Probe Master Mix说明书推荐的20 μL体系：10 μmol/L qF/R 0.4 μL，10 μmol/L Probe 0.2 μL，模板1 μL，ddH2O补足至20 μL；反应条件：37℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环建立初步反应体系，在52℃～64℃范围内筛选最佳退火温度，矩阵法筛选最优引物和探针浓度，优化qPCR的反应体系。

1.6 标准曲线 将NiV 质粒10 倍系列浓度梯度（1.48×109～1.48×100copies/μL）稀释，以稀释后的各浓度质粒为模板，按照优化后的体系进行qPCR试验，每个浓度重复3次，以起始模板浓度的对数及Ct值为横纵坐标绘制标准曲线。

1.7 重复性、敏感性、特异性试验 根据绘制的标准曲线计算变异系数（coefficient of variation, CV）评估方法的重复性，确定检出限，并与常规PCR对比以评估敏感性；以常见猪传染病病毒ASFV的基因组DNA、PRRSV、CSFV、PRV、PEDV的cDNA及健康猪血清为阴性对照，进行qPCR检测，以评价方法的特异性。

1.8 模拟临床样本检测 用健康猪血清10倍系列梯度稀释初始浓度为1.48×109copies/μL的NiV质粒，摸拟不同浓度临床样本。取梯度稀释后的模拟样本200 μL，提取DNA后取100 ng左右为模板进行qPCR试验。

1.9 体外转录制备假病毒检测 以NiV质粒为模板，用含T7启动子的引物进行PCR后得到体外转录模板，T7 High Yield RNA Transcription Kit将扩增产物体外转录为RNA，即为NiV假病毒核酸，将制备的NiV假病毒核酸按10倍梯度稀释成10个浓度作为模板（100～10-9），按优化后的引物浓度及退火温度进行qRT-PCR检测。

2 结果

2.1 反应体系和反应条件的建立与优化 反应体系经优化后的最佳退火温度为64℃，最佳上、下游引物浓度为0.8 μmol/L；探针浓度为0.5 μmol/L（Ct值=20.33±0.13）（表2）。

表2 不同探针和引物浓度下的Ct 值Table 2 Ct values at diff erent concentrations of probe and primers

2.2 标准曲线 超微量紫外分光光度计测得NiV重组质粒浓度为7 ng/μL；根据公式y（copies/μL）=[x(g/μL)/（碱基数×660）]×6.02×1023，换算为1.48×109copies/μL，用ddH2O 10倍梯度稀释至1.48×101copies/μL。标准曲线：Y = -3.27×X+38.673，扩增效率（eff%）为102%，表明扩增效率高，R2=0.996表明不同浓度梯度模板量的对数值与Ct值之间呈现良好的相关性（图1）。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

2.3 敏感性与重复性 将1.48×109～1.48×100copies/ μL的NiV重组质粒重复测定（n=3），测试该方法的重复性。结果显示CV＜2%；可检测到的最低拷贝数为14.8 copies/ μL（表3），表明方法重复性良好，结果稳定（图2），敏感性高于常规PCR（图3）。

图2 NiV qPCR 扩增曲线Fig.2 Amplif ication curve of NiV qPCR

图3 NiV 常规PCR 结果Fig.3 Conventional PCR results for NiV

表3 敏感性和重复性Table 3 Accuracy and repeatability

2.4 qPCR的特异性 用该方法检测ASFV、PRRSV、CSFV、PRV、PEDV均为阴性，仅NiV出现扩增曲线，表明该方法具有高特异性（图4）。

图4 NiV qPCR 特异性Fig.4 Specif icity of NiV qPCR

2.5 模拟临床样本检测 将拷贝数为1.48×109copies/μL的NiV质粒以健康的猪血清为基质进行10倍梯度稀释，设置7个浓度梯度，模拟不同浓度带毒血清样本进行检测。结果显示可检测到稀释度为1×10-5的样本，此时重复性降低，Ct值为37.8，但仍有明显扩增曲线（图5）。

图5 模拟样本中NiV qPCR 扩增结果Fig.5 Amplif ication of qPCR results for NiV

2.6 体外转录制备双链RNA检测 设计含T7启动子的引物，以NiV病毒质粒为模板，通过PCR后得到的扩增产物作为体外转录的模板，进行体外转录，转录产物纯化后得到的RNA为核酸，测得浓度为578 ng/μL，纯度OD260/OD280=1.8，梯度稀释后进行qRT-PCR检测，当RNA模板稀释度为1×10-7时，该方法仍表现出良好重复性，稀释度为1×10-9时仍可出现扩增曲线，但此时重复性差，易出现阴性结果（图6）。

图6 NiV qRT-PCR 扩增结果Fig.6 Results of qRT-PCR amplif ication for NiV

3 讨论

NiV基因组由6个转录单位和3'端的非翻译区组成，6个转录单位为N、P、M、F、G、L，分别翻译为核衣壳蛋白、磷蛋白、膜蛋白、融合蛋白、糖蛋白、大蛋白[1]。NiV的N蛋白和P蛋白可同源结合，也可异源结合形成N-P复合物[11]。副粘病毒的N蛋白为典型的螺旋或人字形结构，通常用于识别该家族的病毒[13]，大多数副粘病毒N蛋白携带所谓的“不变”序列F-X4-Y-P-X3-S-Y-A-M-G，该序列同样存在于NiV N蛋白中[14]，N蛋白在NiV中含量丰富，与副粘病毒亚科中其他病毒的N蛋白仅20%～30%同源性[12]。已有研究使用原核表达系统成功表达了NiV的N蛋白，且能在Western blot反应中与阳性血清反应，说明以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原可行[15]，因此N蛋白的氨基酸和基因序列在NiV的实验室诊断研究中具有重要意义。

随着国际贸易发展，NiV对中国边境的威胁日益显露，但由于其生物等级较高，分子生物诊断方法以敏感性高，易进行的优点成为NiV风险预警的重要方式。本研究根据NiVN基因中有两个ORF，能高效表达且具有高度保守性的特性，设计一对引物和探针，通过优化体系，建立的qPCR方法重复性和稳定性好，敏感性高，标准曲线线性范围为1.48×109～1.48×101copies/μL，Ct值＜35，尽管模板为1.48×101copies/μL时，Ct值＞35，但此时仍有典型扩增曲线且重复性良好，且该方法敏感性高于普通PCR；特异性强，不能扩增出除NiV外其他常见猪病毒核酸。用该方法对质粒混合健康猪血清，及体外转录的RNA进行检测，可检测到1×10-5稀释度的模拟样本中NiV，及1×10-9稀释度的NiV RNA。该方法能够满足未知样本中NiV的定性及定量检测要求，且制备的体外转录双链RNA，浓度高，纯度好，无生物感染性，可作为NiV检测时的阳性对照。