实时荧光定量PCR 检测鸭源鹅细小病毒方法的建立与应用

杨挺懿，杨 婧，黄欣梅，韩凯凯，赵冬敏，章丽娇，刘宇卓，李 银，张小飞，刘青涛

（1.南京农业大学动物医学院，南京 210095； 2.江苏省农业科学院兽医研究所，南京 210014）

鸭源鹅细小病毒（Duck-origin goose parvovirus,D-GPV）是细小病毒科，细小病毒亚科依赖病毒属的单链DNA病毒[1]，它的典型临床症状是短喙，胫骨短，生长迟滞[2]，有学者指出，此病毒可能是通过影响肠道菌群从而导致发病[3]。该病首次报道是在1971年的法国西南地区，在我国最早出现在台湾[4]，而后分别于1995年和2000年在波兰和匈牙利暴发[5]。2014年以后我国许多地区如福建、山东、河北、河南、安徽、江西等地暴发该病，给养鸭业造成了巨大经济损失[6]。

自D-GPV暴发以来，许多学者纷纷建立各种检测方法，王劭等[7]建立了PCR-RFLP技术，有效杜绝了假阳性，但是检测敏感性较低；刘铭[8]通过重组VP2建立了D-GPV ELISA检测方法；Liu等[9]将重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）技术与垂直流（vertical flow, VF）可视化试纸相结合，该方法特异性好和敏感性高，但是由于还没有用于RPA检测的引物设计软件，因此方法的普及受到限制。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）技术，通过在PCR反应体系中加入荧光染料，实时监测整个过程中荧光信号的累计强度，从而达到对反应产物进行定量的目的，省去了普通PCR需要借助核酸电泳进行分析的步骤，结果一目了然，减少了检测时间，大大增加了检测效率，具有快速、简便、特异性好、敏感性高、稳定性好等特点，自问世以来就受到广泛的青睐[10]。

1 材料和方法

1.1 病毒和实验动物 鸭源鹅细小病毒（Duckorigin goose parvovirus, D-GPV）、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）、鸭瘟病毒（Duck plague virus, DPV）、鸭圆环病毒（Duck circovirus, DuCV）、禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4）、H9亚型禽流感病毒（H9N2 subtype of avian influenza virus, H9N2 AIV）、鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）、坦布苏病毒（Tembusu virus, TMUV）、鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus, DRV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）均由江苏省农业科学院兽医研究所分离并保存。鸭购自江苏丽佳禽业有限公司。

1.2 主要试剂和仪器 RNA/DNA、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自康宁公司；Thermal Cycter Dice Real Time System购自TaKaRa公司；T5 Direct PCR Kit (Animal Tissue) 和DH5α感受态细胞购自南京擎科生物公司。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank的D-GPV全基因序列，用DNAStar软件进行同源性分析，选出高度保守并且特异的核苷酸区域，用Primer Express软件设计一对克隆引物，其序列为NS1-F：5'-GGTCGAATTCATGGCACTTTCTAGG-3'和NS1-R：5'-TGAACTCGAGTTATTGTTCA TTTTCAGC-3'，将NS1基因连接到PMD18-T载体中；同时设计一对检测引物NS1-911F：5'-ACTGTGGCACCGCTTATTTC-3'和NS1-911R：5'-ATTTCAGCACGGGCATTCTC-3'，扩增片段为191 bp。

1.4 病毒DNA的提取 按照试剂盒说明书进行提取DNA。

1.5 标准品的制备 将含有病毒的尿囊液旋涡振荡混匀，离心后直接吸取上清液进行PCR，反应体系为：2× T5 Direct PCR Mix（Animal）20 μL，ddH2O 17.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，上清液1 μL。反应条件为：98℃预变性8 min；98℃变性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃再延伸3 min。扩增产物经核酸电泳鉴定后进行胶回收，连接到PMD18-T中，再转化到DH5α感受态细胞，挑选菌落进行培养，提取质粒，进行PCR鉴定和测序分析，筛选出阳性克隆。将质粒用EcoRⅠ单酶切进行线性化，胶回收后测定产物浓度，以此来计算拷贝数，-70℃冻存。拷贝数公式为：6.02×1023（copies/moL）×质粒的质量浓度（g/μL）/质粒分子量（g/moL）。

1.6 标准曲线的建立 将制备的标准品进行10倍梯度稀释（100～107copies/μL）作为模板进行实时荧光定量PCR扩增，得到标准曲线和溶解曲线。扩增体系为：2× ChanQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，引物各1 μL，ddH2O 7 μL，模板1 μL。扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性10 s，60℃延伸30 s，共40个循环。

1.7 荧光定量PCR检测方法的评价

1.7.1 敏感性试验 以10倍梯度稀释标准品进行实时荧光定量PCR，检测出的最低拷贝数即为该方法的灵敏度。

1.7.2 特异性试验 用PCR方法，使用上文设计的检测引物分别对MDPV、DVE、DuCV、FAdV-4、H9N2 AIV、DHAV、TMUV、DRV、NDV、AIBV进行检测，以D-GPV作为阳性对照，评价该引物的特异性。

1.7.3 重复性试验 用建立的方法同时对1×102、1×104、1×106copies/μL的标准品进行检测，同一次试验每个样品设置3个重复，分3个时间进行。根据Ct值计算批间和批内的变异系数，检验该方法的重复性。

1.7.4 泄殖腔与咽喉拭子样品的检测 对4只2日龄雏鸭进行口服攻毒，同时设置对照组，攻毒后第1、3、7、14、21、28、35、42 d分别采集泄殖腔和咽拭子，反复冻融3次后提取DNA，用实时荧光定量PCR进行检测。

2 结果

2.1 标准品的制备 用微量核酸浓度测定仪测定质粒的浓度，得出结果为54.900 ng/μL，按照公式计算得出拷贝数为：1.09×1010copies/μL，分装后-70℃冻存。

2.2 标准曲线的绘制 对10倍梯度稀释（100～107copies/μL）的标准品进行检测。结果显示，标准品在浓度为100～107copies/μL时具有良好的线性关系（图1），其中标准曲线的相关系数R2=0.999，扩增效率为99.1%。并且扩增产物的溶解曲线显示无非特异性产物，均为单一峰（图2）。

图1 标准曲线Fig.1 Standard Curve

图2 溶解曲线Fig.2 Melt Curve

2.3 敏感性试验结果 标准品（100～107copies/μL）的检测结果显示，在标准品浓度为101copies/μL时仍有稳定的阳性扩增信号，该实时荧光定量PCR的检测最低拷贝数为10拷贝（图3）。说明该方法可以对拷贝数大于等于10的样品进行定量检测。

图3 扩增曲线Fig.3 Amplif ication plot

2.4 特异性试验结果 用本文所设计的荧光定量PCR检测引物对D-GPV和其他10种病毒进行PCR扩增，结果显示D-GPV样品可以扩增出阳性条带，而其他病毒均为阴性，这说明本文所设计的引物具有良好的特异性（图4）。

图4 特异性试验Fig.4 Specif icity Test

2.5 重复性试验结果 对不同标准品的3次批内重复和3次批间重复测定结果显示，各标准品的批内变异系数为0.17%～0.4%，批间变异系数为0.35%～0.88%，表明该方法重复性良好（表1）。

表1 重复性试验Table1 Repeatability test

2.6 D-GPV攻毒样品的检测 由D-GPV攻毒鸭泄殖腔和咽拭子检测结果显示，鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒，排毒量在第3 d达到高峰，并且泄殖腔的排毒量明显高于口腔。另外，鸭在攻毒后42 d仍然可以通过口腔和泄殖腔向外排毒（表2），这说明鸭在感染D-GPV后可以长期带毒、排毒。

表2 D-GPV 在人工感染雏鸭后咽拭子和泄殖腔拭子的qPCR 检测结果Table 2 Detection results of D-GPV in cloacal and oropharyngeal swabs of artif icially infected ducks by qPCR

3 讨论

自2014年我国暴发D-GPV以来，多地养鸭业受到严重的经济损失。虽然该病致死率不高，但是一旦发病，僵鸭淘汰率可高达80%[11]，将严重影响经济效益。因此，为准确诊断病原，减少养殖业经济损失，预防该病毒的大面积传播，快速、灵敏且准确的检测方法必不可少。

本研究根据D-GPV的基因保守区，设计了一对特异性的引物，建立了针对D-GPV的实时荧光定量PCR方法。结果显示，本研究建立的qPCR方法敏感性高，最低可检测10个拷贝；特异性很好，溶解曲线均为单一峰，检测MDPV、DPV、DuCV、FAdV-4、H9N2 AIV、DHAV、TMUV、DRV、NDV、IBV等病毒均显示阴性；重复性好，批间和批内的变异系数较小；在对攻毒样品的检测中，该方法的检出阳性率为100%。因此，本研究所建立的qPCR方法具有快速、灵敏、稳定等特点，适合用于临床样品的D-GPV快速检测。此外，该方法的标准曲线线性关系好，相关系数R2=0.999，扩增效率为99.1%，可以用于病毒的定量检测。

用该方法对D-GPV感染鸭的泄殖腔和咽喉拭子样品的检测结果显示，雏鸭感染D-GPV后第1 d即可在咽拭子和泄殖腔拭子中检测到病毒，病毒载量在感染后第3 d达到峰值，随后逐渐减少，但在感染后第42 d仍可检测到病毒；同时通过观察临床症状发现攻毒组中4只鸭均出现体重减轻现象，但仅有2只出现明显短喙症状。表明一旦感染该病毒，宿主可能不表现明显的典型症状但可以长期通过唾液和粪便排毒，在养殖过程中不断水平传播造成大面积感染，从而导致经济损失。根据以上结果，养殖过程中应尽可能减少病毒水平传播的可能，做好水槽、食槽等器材的消毒工作并对排泄物进行无害化处理。