石墨烯及其衍生物的理化性质和应用研究进展

邝一深 综述 李祥伟 审校

近年来,石墨烯及其衍生物凭借其独特的物理、化学和生物学性能被广泛运用于生物医药载体、肿瘤治疗及组织工程等领域。其中,组织工程是利用干细胞、生长因子和支架修复组织缺损并恢复组织生理功能的过程。支架支持干细胞特异性分化为骨、血管和神经等组织,因此,支架在组织工程中具有至关重要的作用。石墨烯及其衍生物被广泛应用于组织工程领域。本文对石墨烯及其衍生物的理化性质和生物学研究进展进行综述。

1 石墨烯(Gp)的理化性质

石墨由蜂窝状的平面碳原子层层有序排列堆叠而成,而石墨烯是通过机械分离方法从石墨中分离出来,是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成的六角型平面多环芳香烃原子晶体[1],也是世界上最薄(只有一个碳原子厚度)、最坚硬的平面薄膜纳米材料[2],具有高导热系数、高电子迁移率、低电阻率、高机械强度、高比表面积和低密度等特点[3]。同时,石墨烯具有良好的力学性能,弹性模量达到1 TPa,压缩强度为45 GPa,是理想的高强度材料[4],因此,在电子、航天、光学、力学和储能等领域,石墨烯具有广阔的应用前景。

石墨烯的衍生物有氧化型 (G0)、还原型(rG0)、氟化型和氮化型石墨烯等。在医学领域,研究和应用较多的是氧化石墨烯,因其表面带有大量亲水性含氧官能团,具有良好的生物相容性和溶液中稳定性[5],同时,通过化学修饰石墨烯,产物具有更多功能而被应用于更多领域[6]。石墨烯及其衍生物在医学领域的应用受到广泛关注,由于独特的物理和化学性质,常被应用于基因或药物载体构建、生物检测、肿瘤治疗、抗菌材料研制和组织工程等方面[7-8]。

2 石墨烯及其衍生物的改性修饰和作用

与不同材料结合后,石墨烯及其衍生物的修饰产物的性质会得到进一步优化,与金属纳米颗粒或有机材料结合可增强抑菌、改善物理性质和生物相容性等。

2.1 石墨烯及其衍生物与金属纳米颗粒复合

有研究者利用石墨烯/氧化锌(GZNC)纳米复合材料构建种植体涂层,研究表明,GZNC可有效抑制种植体周围形成生物膜、降低变形链球菌的致龋性和纳米复合材料的毒性,因此,GZNC可成为一种抗菌性种植体涂层材料。如将GZNC应用于临床,还需要明确涂层的稳定性[9]。氧化石墨烯-银(GO-Ag)和 L-半胱氨酸功能化修饰氧化石墨烯(GO-L-cys-Ag)纳米复合材料在非常低的剂量下,对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有较高的抗菌效果。进一步研究表明,GO-Ag 和 GO-L-cys-Ag对革兰氏阴性菌的杀菌机制是该复合材料破坏细菌细胞壁或细胞膜的完整性,而对革兰氏阳性细菌的抑菌作用机制则是抑制细菌细胞的分裂[10]。钛表面氧化石墨烯携载盐酸米诺环素涂层(M@GO-Ti)表现出缓释特征,并对需氧菌表现出优异的抑制作用,对兼性厌氧菌和厌氧菌具有触杀和释杀的协同作用。同时,在体外,可促进人牙龈成纤维细胞(HGF)增殖,这说明在有金黄色葡萄球菌存在的情况下,人牙龈成纤维细胞在M@GO-Ti 具有较高的细胞黏附效率,这对临床种植修复具有重要意义[11],有望应用该材料促进种植体周围良好的软组织封闭作用。研究发现,经微弧氧化的钛合金结合1.0 mg/mL氧化石墨烯复合物(Ti-MAO-1.0 mg/mL GO)可以显著增强人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)在Ti表面的黏附、增殖和牙源性分化,该复合材料也具有抗菌活性。微弧氧化(MAO) 涂层具有多层、多孔结构, 结合GO的物理和化学性质有助于封闭牙髓环境和修复牙体结构,具有潜在的临床应用价值[12],可作为封闭牙髓再生环境和恢复牙体合面咬合形态的修复材料。

2.2 石墨烯及其衍生物与有机功能结构的复合

与羟基磷灰石(hydroxylapatite, HA) 相比,还原型氧化石墨烯/氟羟基磷灰石(rGO/FHA)复合材料的硬度和断裂韧性分别提高了86% 和137%。进一步研究证实, rGO和F-离子的共同作用可促进成骨细胞增殖和分化。此外,rGO/FHA具有抗菌作用。这为rGO/FHA在临床中用作种植体的修饰材料奠定了理论基础[13]。另有研究表明,添加HA和改性GO 可以提高聚乳酸(poly lactic acid, PLA)基纳米复合材料的疏水性,而且,聚乳酸/羟基磷灰石/氧化石墨烯(PLA/HA/GO)复合材料的拉伸强度随着GO含量的增加而增强,具有优异的力学性能[14]。此外,HA添加GO和碳纳米管(carbon nanotubes, CNT)可显著改善HA的表面润湿性、硬度和粗糙度[15],因此,氧化石墨烯/碳纳米管/羟基磷灰石(GO/CNT/HA)复合材料可作为骨移植材料的替代品。

3 石墨烯及其衍生物的细胞学作用

石墨烯及其衍生物对不同干细胞具有不同的促分化作用,如可以促进成骨分化、神经、肌肉、血管分化和矿化等。

3.1 促进干细胞成骨分化

有研究发现,无论是在没有添加任何骨诱导剂的基础培养基还是在成骨培养基中,还原型石墨烯羟基磷灰石(rGO-HAp)复合物均可促进人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)及骨祖细胞的成骨分化。提示,在没有炎症反应的情况下, rGO-HAp 复合物能够显著促进全层颅骨缺损的新骨形成[16],该材料可作为颅骨缺损的修复材料。通过聚乙烯亚胺功能化的氧化石墨烯(GO-PEI)可明显促进hMSCs增殖和黏附,并且具有高效诱导干细胞成骨分化和杀菌作用[17-18]。因此, GO-PEI能够用于制备可生物吸收性修复材料,应用于骨折固定、组织工程和牙齿矫正等。与地塞米松(DEX-Control)和还原型石墨烯-地塞米松(DEX-rGO-Ti)的培养基相比, hBMSCs在氧化型石墨烯-地塞米松钛表面(DEX-GO-Ti) 的增殖率更高, 而且成骨分化更显著[19]。可见,表面负载DEX-GO的钛酸盐涂层赋予了钛种植体良好的生物学活性,为钛种植体的改性修饰提供了理论依据。另有研究发现, GO可促进山羊BMSCs增殖和成骨分化,并具有良好的生物相容性[20], 2D Gp和 3D Gp可促进牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)成骨分化[21],因此,石墨烯可考虑作为骨组织再生的基质。与Na-Ti基质相比,PDLSCs在GO-Ti基质上显示出更高的增殖率、ALP活性和成骨相关基因的表达水平[22]。因此,GO-Ti在骨组织工程领域具有潜在的应用前景。

3.2 促进细胞成神经、成肌分化

另有研究发现,不同形式的氧化石墨烯、部分还原型石墨烯和完全还原型石墨烯对多巴胺能(dopaminergiccells, DA)神经细胞具有不同的影响和作用,而且,关于抑制细胞增殖和促进神经元分化作用,薄膜状石墨烯比粉末状石墨烯作用更显著。部分还原型氧化石墨烯薄膜(PRGO-film)最适合DA神经细胞培养,因为它能够促进小鼠多巴胺能神经细胞(SN4741)中脑DA表达,而且不影响细胞代谢或线粒体功能, PRGO-film对DA神经细胞具有保护作用。因此,PRGO-film是一种具有潜在应用前景的支架材料,有研究者将该材料应用于帕金森病DA神经细胞替代治疗的探索研究[23],具有高度褶皱结构的GO薄膜有利于细胞形成更大的黏附区和更高水平的成肌分化率。此外,苯丙氨酸和赖氨酸功能化的GO薄膜比单纯的GO薄膜显著提高小鼠成肌细胞(C2C12)成肌分化率[24]。

3.3 促进牙髓再生

低浓度的GO-Cu(<10 mg/mL)可促进牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)的活力、增殖、诱导成牙分化和神经血管形成[25]。GO可促进DPSCs黏附、增殖并可促进矿化相关基因表达[5],可见,GO-Cu是一种颇具潜力的牙髓再生材料。另有研究表明,氧化石墨烯量子点(graphene oxide quantum dots, GOQDs)可以促进人脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHEDs)黏附、增殖和早期成骨相关基因表达[26]。3D石墨烯泡沫和58 s生物活性玻璃复合(3DGF/58SBG)构建的支架具有较大的表面积、良好的生物学作用和电活性,该支架可通过较强的生物电刺激促进细胞黏附、增殖和分化,进而显著促进骨再生[27],说明,石墨烯作为再生载体或支架材料,但需要筛选和明确适宜的浓度。

牙髓位于髓腔内,被牙本质包绕,通过根尖孔、侧支根管及副根管于牙周组织相连。牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)由Gronthos等[28]于2000 年首次发现,与骨髓间充质干细胞具有极其相似的免疫表型和形成矿化结节能力,细胞形态呈梭形,可自我更新和多向分化,具有较强的克隆能力,存在于牙髓核心和细胞富集区。研究表明,DPSCs具有分化为成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪细胞和神经样细胞等潜能,是牙髓再生常用的种子细胞[29]。组织工程涉及干细胞、支架和生长因子三大部分。石墨烯及其衍生物可促进DPSCs黏附、增殖和分化。体外实验中,检测DPSCs黏附能力的方法主要有通过扫描电镜来观察细胞特征,通过RT-PCR或是检测细胞黏附相关的整合素β1的表达情况[30]。

石墨烯及其衍生物可促进DPSCs黏附不同基底黏附,若欲将DPSCs作为牙髓再生的种子细胞,在进行体外实验检测细胞学作用时,需将其接种于牙本质表面或相关支架材料上,通过观察DPSCs的成骨、成血管和成神经分化等效果,以判断DPSCs的自我更新和多向分化能力,DPSCs黏附牙本质片或相关支架材料的效果将决定牙髓再生的效果[5,25-27]。若将DPSCs直接置入离体牙根管内进行牙髓再生,到达根管的DPSCs数量有限,而且其在根管内分布不均匀,因此很难再生完整的牙髓组织[31]。所以,探索可辅助细胞黏附根管壁进而促进细胞黏附和分化的措施一直被研究者们的努力方向。石墨烯及其衍生物是否能够改善DPSCs黏附牙本质,进而使DPSCs均匀分布于根管内壁表面,这有待进一步研究。

4 展 望

石墨烯及其衍生物在牙科种植体、骨缺损的修复和再生领域已有较多基础研究和临床运用研究。基于不同的修饰方式、应用形式、材料浓度,石墨烯及其衍生物具有不同的细胞学作用和细胞毒性,其适当应用可优化基底表面性质,增强抑菌作用、促进干细胞黏附、增殖和分化,而关于石墨烯及其衍生物在牙髓再生中黏附效果有待进一步研究和探讨。