外泌体在牙周再生应用的研究进展

黄欣悦 龚旭 郭维维 张滋彬 公梓昊 综述 王忠山 审校

近几年口腔流行病学调查显示,牙周疾病以高达90%的患病率成为中国人群中最常见疾患之一[1]。牙周疾病不仅会导致牙槽骨的不可逆性吸收,影响咀嚼功能及美观,降低生活质量[2],还和心血管疾病、2型糖尿病(T2DM)等全身系统性疾病相互影响[3-4]。牙周病现有治疗包括牙周基础治疗、翻瓣手术、引导性骨再生,但仅能控制疾病进展,骨修复能力有限[5]。近年来,牙周组织再生成为牙周病治疗研究中的热点和挑战。

外泌体是一类来源于核内体的小囊泡结构,直径约30～160 nm,由细胞质中内涵体界膜向内凹陷形成管腔状囊泡,经过组装逐步具备动态亚细胞结构。当其运动至细胞膜后在信号分子指导下以外出芽方式形成颗粒状小囊泡并释放到细胞外环境[6]。Skotland 等[7]发现外泌体具有脂质双层结构。此外还发现外泌体含多种母细胞源性生物学信息,既能清除细胞中多余或不必要物质,维持细胞内环境稳态,又能在细胞之间传递亲本细胞的特异性物质[8]。

1 不同细胞来源外泌体

不同组织细胞来源的外泌体具有不同的生物学特征[9-10]。当组织出现损伤时,外泌体会被吸引到该区域,并释放因子促进损伤组织增生分化和自我修复。

在口腔器官发育过程中上皮细胞(epithelium cells, ECs)和间充质细胞(mesenchyme cells, MSCs)会分泌外泌体,并扩散到基膜使得各细胞群及时进行信息交流,确保发育有序进行[11]。人脂肪间充质干细胞(human adipose mesenchymal stem cells, hASCs)分泌的外泌体(hASCs-Exos)可以调节切口创面的collagen type Ⅲ: type I、TGF-β3 : TGF-β1和MMP3∶TIMP1比例,加快皮肤创伤修复过程中的细胞外基质重建,减轻瘢痕形成[12]。国内赵彬等[13]将来源于5 名产妇的人羊膜上皮干细胞(human amniotic epithelial stem cells, hAECs)培养至第三代,通过成骨、成脂诱导分化后分成对照组和不同外泌体浓度的实验组,发现100 μg/mL外泌体组大鼠皮肤组织创面胶原纤维排列更整齐。人骨髓源性基质细胞(human bone marrow derived stromal cells, hMSCs)是一类存在于哺乳动物骨髓基质中并具有极强分裂能力的细胞,可以在一定条件下分化成骨、软骨、脂肪、神经等组织[14]。hMSCs分泌的外泌体(hMSCs-Exos)可以促进牙周膜细胞的增殖和克隆,并能促进其成骨作用。有学者将hMSCs和人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)分泌外泌体(hDPSCs-Exos)分别与基质蛋白结合,来探索不同干细胞来源外泌体在牙髓再生工程中的应用效果,发现不同细胞来源的外泌体具有不同的诱导干细胞特异性分化的潜力,提示在应用于牙髓、牙周再生前应考虑外泌体供体细胞来源和状态的重要性[15]。费栋栋等[16]通过有限稀释法筛选成骨强的人牙周膜干细胞亚系(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs),其产生的外泌体通过诱导靶细胞组蛋白H3、 H4乙酰化水平的改变进而影响组蛋白乙酰转移酶的表达,对靶细胞(hPDLSCs)成骨分化进行调控。

近年来也有不少研究发现,不同种类干细胞来源外泌体联合应用可以得到更好的治疗效果。 Narayanan等[17]联合使用成骨细胞来源外泌体(osteoblasts-derived exosomes, Os-Exos)和脂肪细胞来源外泌体(adipocytes-derived exosomes, Ad-Exos),发现可以在较早分化时间点开启谱系特异性基因的表达。

但是,当前想要获得高纯度外泌体仍有一定困难,可以参考国际细胞外囊泡协会提出的指南,结合新的实验技术和方法来获取外泌体。用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对牙囊细胞(dental folic cells, DFCs)来源外泌体(DFCs-Exos)进行预处理,探索不同浓度DFCs-Exos对牙周炎患者成骨能力的影响。最后发现100 μg/mL DFCs-Exos 组PDLSCs成骨分化能力较强,更有利于促进牙周组织再生[18]。 Yang等[19]发现经过根尖牙胚细胞培养液(APTG-CM)诱导的PDLSCs可以向牙骨质、牙周韧带样组织分化。由此说明APTG-CM能够提供一个成骨水泥的微环境,并诱导PDLSCs向成骨细胞谱系分化。

目前将外泌体应用于牙周再生的相关报道和可靠数据较少,但是联合应用组织工程技术,将某种具有特定功能的外泌体移植到牙周缺损处,以此促进相关组织的诱导发生、成熟和神经血管再生,得到了初步的证实。

2 外泌体分泌的活性物质

外泌体通过释放蛋白质、RNA等活性物质,对机体生命活动进行调节。Valadi 等[20]发现肥大细胞系(mast cells-MCs)来源外泌体(MCs-Exos)内含有mRNA和microRNA,它们在不同物种细胞之间相互传递,并在新位置发挥功能。刘世宇等研究hMSCs-Exos 对hPDLSCs 增殖和分化功能的影响,分别检测实验组(用hMSCs-Exos处理hPDLSCs)和对照组hPDLSCs的成骨相关基因表达(Runx2、OCN、ALP、BSP、Col-Ⅰ)的增殖速率及其克隆能力,结果显示实验组显著高于对照组[21]。炎症会增加PDSLCs的外泌体分泌,并促进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells, HUVECs)的血管生成,而阻断外泌体的分泌会导致HUVECs血管生成的退化。外泌体分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)被证明是PDLSCs和HUVECs之间的关键信号分子[22-23]。

随着研究不断深入,各种活性物质的种类、功能属性和作用机制将有可能被更好地了解和掌握,未来或许可以实现含有特异性活性物质的外泌体的批量生产,对病损牙周组织进行个性化修复,造福牙周病患者。

3 工程化外泌体的应用

基于外泌体的分子运输能力以及靶向特性,通过对外泌体表面分子的修饰改造赋予其细胞和组织特异性(靶向修饰),而通过在供体细胞内共表达蛋白质/RNA转运物也可以将特定的蛋白/RNA分子装载到外泌体中(目的分子装载)。工程化外泌体具有高产量、高靶向效率、高目的蛋白/RNA装载效率等多重作用[24]。

将细胞疗法应用于牙周炎等炎症相关疾病在实验阶段已经取得一定进展。Xu等[25]研究发现经P2X7受体(P2X7R)基因修饰的干细胞来源外泌体分泌miR-3679-5p、 miR-6515-5p、 miR-6747-5p,这些物质与GREM-1蛋白结合,逆转炎症介导的PDLSCs损伤。可以采用挤压方法从hMSCs中积累外泌体模拟物(exosome mimetics, EMs),与hMSCs来源的外泌体相比,收集到的EMs产量显著提高。通过转染noggin shRNA进一步下调天然骨形态发生蛋白(BMP2)拮抗剂noggin的表达以增强EMs的成骨特性[26]。Exo-181b通过抑制PRKCD和激活p-AKT显著增强M2型巨噬细胞极化,抑制炎症及增强骨整合。此外,还证实了增强的M2型巨噬细胞极化可通过体外分泌VEGF和BMP-2间接促进骨迁移和成骨分化[27]。

外泌体的工程化改造是赋予其新特性的便捷方法,随着研究的不断进展,相信将来可以攻克这一难关。

4 外泌体与复合支架材料的联合应用

研究者发现,单独将外泌体定植在病损牙周组织,新生细胞会受到生长空间和生存环境限制,修复效果欠佳。生物相容性复合材料可以作为支架有效引导修复组织在空间合理分布,并提供生理性牙周环境,有利于细胞增殖。将牙釉质基质蛋白衍生物和骨生长素分别与胶原海绵(absorbable collagen sponge, ACS)联合使用,发现两组都形成新的结缔组织附着和新骨,说明ACS可作为牙周愈合实验理想支架材料[28]。ACS具有放射透明性、相对惰性和可吸收性。在大鼠牙周缺损模型中,植入带有间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)培养基(MSC-CM)的ACS,发现缺损处骨和血管生成相关基因的表达水平显著上调[29]。此外, Li 等[30]将hASCs-Exos固定在聚多巴胺涂层的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA/pDA)支架上,构建出一种新型无细胞组织工程骨,来诱导成骨作用。后发现外泌体从PLGA/pDA支架缓慢释放,显著增加了骨再生效率。上述无细胞系统为如何治疗缺失牙槽骨提供了新的思路。 Shen等[31]发现将hDPSCs-Exos和壳聚糖水凝胶(chitosan hydrogel, CS)结合形成的(hDPSCs-Exos/CS)可以促进小鼠牙周炎区域的巨噬细胞由促炎表型向抗炎表型转化。提示或许可以利用CS结合外泌体来抑制牙周炎症和调节免疫应答,改善牙周损伤。值得重视的是, Liu等[32]首次系统综述了干细胞、 3D打印、基因治疗和分层生物结构技术,应用于牙周(牙槽骨-牙周韧带-牙骨质复合体)再生方面的新进展。实验先通过细胞归巢避免伦理问题和防止免疫排斥反应;其次, 3D打印可以使牙周膜纤维具有定制的仿生结构和生物活性成分;基因治疗还可以精准靶向调控缺损微环境,具有分别促进牙骨质、牙周韧带纤维、牙槽骨再生的功能;最后通过分层设计材料实现牙周组织完整、同步再生。除了细胞归巢、基因治疗和层状材料用于牙周再生的研究仍处于实验室研究阶段,其他的治疗材料已经被批准用于临床治疗。这个实验为如何同步恢复丧失的牙周组织提供了极好的设想。在巨噬细胞模拟的炎症环境中,用Ag离子和MSCs-Exos修饰PCL支架,发现该支架显著降低了促炎基因的表达和减少了IL-6、 TNF-α的分泌,并促进hBMSCs成骨分化[33]。近年来,负载有外泌体的β-TCP复合支架也在逐渐推广。

这些研究成果为外泌体和生物相容性复合支架材料联合应用奠定了基础。

5 外泌体在牙周再生治疗中的新功能展望

基因疗法有望从分子层面更精准有效地直接治疗疾病。在这里我们综述了在基因水平对外泌体进行操作,进而运用于临床中牙周再生治疗的可能性。

基因治疗可以将干细胞及其衍生物变成靶向基因的载体,引导人体疾患朝着纠正、组织修复和再生的目标发展[34]。规律间隔成簇短回文重复序列/规律间隔成簇短回文重复序列相关蛋白系统(CRISPR/Cas)是存在于细菌与古菌的一种防御机制,目前在基因组研究领域得到广泛应用[35-36]。 Lin等[37]研制出一种外泌体脂质体杂交纳米颗粒,用于传递CRISPR/Cas系统。负载的混合外泌体可以被MSCs内吞并释放该系统,从而调控MSCs中靶向基因的表达。在未来,我们是否可以利用外泌体,将携带纠正牙周炎症相关基因的CRISPR/Cas系统导入干细胞用以介导牙周组织修复,值得探索。

大量研究表明,在炎症微环境中PDLSCs的免疫调节能力和再生潜能会受到损伤[38],进而降低移植干细胞治疗效果[39]。P2X7R表达于大多数干细胞,在炎症反应中发挥广泛的生理和病理作用[40]。 Xu等[41]通过实验发现炎症条件会降低PDLSCs中P2X7R表达,而通过BzATP激活P2X7R或通过基因转导过表达P2X7R,可以逆转炎症介导的牙槽骨进行性吸收;此外,该团队又发现PI3K-AKT-mTOR通路与牙槽骨成骨过程相关。当干细胞及其衍生物移植到牙周炎区域,它们功能会受到影响,导致干细胞疗法用于牙周再生的临床应用进展缓慢;为了探究P2X7R基因对周围环境的影响,将经过P2X7R基因修饰的干细胞条件培养基(CM-Ad-P2X7)与外泌体(ex-ad-p2x7)联合用于孵育PDLSCs。发现在炎症微环境下, ex-ad-p2x7通过修改不利的局部微环境使PDLSCs脱离功能障碍。在牙周再生过程中使用ex-ad-p2x7,不仅提高干细胞治疗的安全性和有效性,还不会引起副作用,为牙周炎的临床治疗提供了一种可行而有前景的方法。当然,还需要更多的体内实验来验证P2X7R对组织再生的积极影响及其安全性[25]。

简而言之,将来可以将基因分子技术和外泌体相结合,在未来有望使牙周炎得到更精准有效的治疗。

综上所述,越来越多证据表明外泌体在牙周再生中发挥着十分重要的作用。近年来,外泌体对牙周炎等口腔疾病的治疗作用也受到较高关注,这也提供了更全面的研究资料[42]。此外,含有多种生物活性分子的外泌体显示出巨大的潜力,这些分子不仅可以用于临床治疗,还可用于协助临床诊断和评估预后等整个疾病的全过程。本文基于不同细胞来源的外泌体及其种类、其所分泌的活性物质、应用的新技术和新方法和未来研究方向等作了相关的讨论。目前基于外泌体用于牙周再生的研究水平仍然不够成熟,距离将理论转化为实际运用于临床还有很漫长的路要走。值得注意的是,外泌体的优势已日益显著。在未来的牙周再生领域,将外泌体与基因分子技术结合,是一个新的趋势。