脱细胞外基质在口腔组织再生中的研究进展

徐庭瑞 付 钰 吕雯昊 马 宁 张 莉

口腔颌面部软硬组织的缺损严重影响患者的口腔功能,采用自体组织进行修复是一种理想的方式,但自体组织存在着来源不足和供区二次损伤的缺点[1]。组织工程和再生医学的发展为口腔组织的修复与再生提供了新的思路。组织工程的原理是在体外模拟体内的组织微环境，将种子细胞接种至支架材料上培养形成工程化组织再植入体内修复或再生体内缺损组织或器官，生长因子和外部物理因素也是组织工程中的重要要素[2，3]。支架材料在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）形成期间为再生的细胞提供机械支持，是组织工程的核心部分[4]。其中具有良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性的天然生物材料被广泛用于制备支架。脱细胞外基质（decellularized extracellular matrix，dECM）作为一种天然生物材料在组织再生中体现出了巨大的优势。近年来越来越多的学者开始关注dECM，并对其在口腔医学领域进行了一些基础研究和临床应用方面的探索。本文对dECM 的研究现状作一综述，旨在为dECM在口腔组织再生中的应用提供参考。

一、dECM的概念、来源和分类

dECM 是指经物理法、化学法及生物法等方式脱去组织或器官中的细胞后形成的生物材料，其可以直接作为支架材料，也可以加工后形成颗粒、水凝胶或生物墨水等形式加以应用[5，6]。dECM 保留了ECM 的基本结构和大部分有机成分，具有良好的生物相容性、可降解性和诱导组织再生能力[7，8]。根据ECM的起源，dECM可分自体dECM、同种异体dECM和异种dECM 三大类，其中同种异体dECM 和异种dECM 应用较广泛[8]。根据ECM 的来源，dECM 可分为组织或器官来源和细胞来源两类。组织或器官来源的dECM 是指通过对组织或器官进行脱细胞处理而形成的三维立体结构，这种dECM 保留了原组织或器官的复杂结构，因此其生物学性能更接近天然ECM[9]。细胞来源的dECM 是指对体外培养的细胞产生的特异性ECM 进行脱细胞处理后获得的材料，与组织或器官来源的dECM 相比，细胞来源的dECM相对更容易获取[10]。目前报道的应用于口腔组织再生的dECM 包括脱细胞牙髓（decellularized dental pulp，DDP）、牙周膜dECM、骨脱细胞外基质（decellularized bone extracellular matrix，dbECM）、颞下颌关节盘dECM、小肠粘膜下层dECM、脱细胞神经移植物（acellular nerve grafts，ANGs）和脱细胞牙胚等，不同dECM 的三维结构和成分的差异使其在口腔组织再生中发挥不同的作用[4]。

二、dECM的主要成分和作用

dECM 主要包含各种细胞因子、糖胺聚糖和蛋白成分[11]。细胞因子在体内释放后可以直接作用于细胞，在调节各种细胞的功能中起着重要作用。糖胺聚糖，主要包括肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸，是一类高度水化、具有凝胶性质的物质，这些聚合物可以通过与各种结构蛋白和细胞因子相互作用来调节细胞活动[12]。各类蛋白成分在dECM中同样发挥着重要的作用。结构蛋白或纤维蛋白，包括胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白等以纤维的形式存在，这些蛋白质构成的细胞外网络具有较高的机械强度，使组织或器官能够承受重复的压力和张力[6]。层粘连蛋白和纤连蛋白表面具有特定的受体结合位点，它们作为一个桥梁将ECM 与基质内的细胞相关联，传递各种信息及调节细胞行为[13]。dECM中保留的主要成分有重要的意义，移植于体内组织缺损部位后可以通过激活多种信号通路调节细胞与细胞和细胞与基质间的相互作用，参与组织的修复和再生[14，15]。

三、dECM与口腔组织再生

1.牙髓组织

DDP 是牙髓再生中常用的一种dECM，由人或动物的牙髓组织经酶和化学物质脱细胞处理制成，其可以为干细胞增殖和分化提供合适的微环境[16]。DDP 中保留的血管内皮生长因子-A 和成纤维细胞生长因子-2 可以使人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的含激酶插入区受体和血小板内皮细胞粘附分子-1 表达上调，在牙髓再血管化过程中发挥作用[17]。Hu L等[18]用1 mm 厚的人磨牙牙根切片作为载体搭载猪DDP 和hDPSCs 后移植到裸鼠皮下，2 月后发现牙根切片内有髓样组织和矿化组织的生长，并在再生的髓样组织中观察到了血管样结构。除了DDP 以外，其他组织的dECM也可以促进牙髓再生。Bakhtiar H 等[19]将人羊膜dECM 接种hDPSCs 后置入完成预备和消毒的牙根根管内，将牙根植入小鼠颅骨7 周后可见高度血管化的髓样组织充满根管。以上结果提示dECM 在牙髓再生血管化过程中发挥了重要作用，但实现牙髓牙本质复合体再生还需要诱导干细胞多向分化。研究表明dECM 可通过Wnt/β-catenin 信号通路上调Wnt3a 基因的表达，诱导干细胞分化生成血管、神经和牙本质，在牙髓牙本质复合体再生中发挥作用[20]。基于此理论，有学者[21]发现DDP 水凝胶支架可以使人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs）的牙本质基质蛋白-1、Ⅰ型胶原和牙本质涎磷蛋白表达水平升高并促进hBMMSCs 牙源性分化。另有研究[22]表明DDP水凝胶可以促进hDPSCs向成牙本质样细胞、神经样细胞和血管生成细胞分化。牙髓再生标准在于牙髓充满血管、神经元形成和牙本质的沉淀，其关键因素在于牙髓血管网络的重建[23]。dECM 在牙髓再血管化和诱导干细胞多向分化中具有重要作用，这为牙髓牙本质复合体再生过程中血管、神经和牙本质的形成提供了重要基础。水凝胶形式的dECM 具有良好的流动性和可塑性，有望为牙髓生理性再生提供一种新的可能途径，但其能否在复杂的根管环境中发挥作用仍需进一步的研究。

2.牙周膜

慢性牙周炎是导致牙周组织丧失最常见的因素，常规的牙周基础治疗只能消除牙周组织的炎症，防止牙周组织被进一步破坏，但无法实现完整的牙周组织再生[24]。牙周膜的再生是牙周组织再生的关键，目前的一些生物合成材料和生物膜等在牙周膜再生中的作用有限，许多学者评价了dECM 在牙周膜再生中的作用。Nakamura 等[25]用十二烷基硫酸钠对带有牙齿的小鼠下颌骨进行脱细胞处理，之后通过拔除牙齿制备了带有牙周膜dECM 的小鼠下颌骨，发现牙周膜dECM 可以引导宿主细胞在体内的迁移和排列，使细胞与原来的牙周膜细胞排列相同，证明了牙周膜dECM 具有一定的引导组织再生能力。但是直接制备牙周膜dECM 比较复杂，且容易破坏牙周膜，提示应用其他组织来源或细胞来源的dECM 有望成为一种崭新策略。Xiong X 等[26]将人尿源性干细胞体外诱导培养后对其进行脱细胞处理，制备成人尿源性干细胞脱细胞外基质（decellularuzed extracellular matrix from human urine-derived stem cells，U-dECM），将人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）接种于U-dECM 上培养，发现U-dECM 可以促进hPDLSCs 的增殖和粘附。上述研究证实dECM 在牙周膜再生中具有一定的作用，未来可将不同干细胞来源的dECM 或其他组织来源的dECM应用于牙周膜再生中。但长期的慢性炎症会导致宿主间充质干细胞数量减少及牙周菌群失衡，如何使dECM 在这个复杂的环境中诱导牙周膜再生是今后研究的重点[27]。

3.骨组织

由创伤、感染和手术造成的颌骨缺损严重影响患者的美观、咀嚼和吞咽，自体骨或同种异体骨移植是临床上修复颌骨缺损的金标准[28]，但自体骨来源有限及异体移植的伦理问题等缺点限制了其应用。近年来，学者们发现dbECM 在骨再生中具有很大的潜力。dbECM 通过化学物质和酶等处理脱去骨组织中细胞成分获得，它既保留了天然骨ECM 中的主要成分，同时具有良好的力学性能和诱导成骨能力[29]。Paduano F 等[30]研究表明牛dbECM 水凝胶可通过上调牙髓干细胞成骨特异性基因RUNX-2 基因、骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达水平调控其成骨分化。另有学者[31]将猪dbECM 植入10 名眶底骨折的患者体内进行眶底重建，发现其在人体内具有良好的生物相容性并显著促进成骨。除了dbECM 以外，其他组织的dECM 也有促进成骨的作用。Alksne M 等[32]制备了大鼠DPSCs 来源的DDP，体外细胞实验发现DDP 可以促进DPSCs 的粘附、迁移和增殖，并且对DPSCs的成骨分化具有诱导作用。Guo K 等[33]对人牙进行脱细胞脱钙处理后植入大鼠颅骨缺损中，发现其具有诱导成骨能力和良好的生物相容性。不同来源的dECM 在体内和体外实验中均表现出了良好的成骨能力，dbECM 可直接作为支架材料用于骨组织再生。但细胞来源的dECM 由于力学性能不足限制了其在骨组织工程中的应用，将其与生物相容性良好的高分子材料复合制备成一种既具有良好的力学性能又可以保存dECM 生物学活性的支架材料是一种理想的方案[34]。

4.颞下颌关节盘

颞下颌关节盘是位于下颌骨髁突和颞骨关节窝之间的纤维软骨样组织，是颞下颌关节行使功能的主要组成部分和重要基础，关节盘穿孔（disc perforation，DP）是常见的颞下颌关节紊乱病之一[35]。DP 的治疗遵循一个循序渐进的原则，首先是进行保守治疗如服药、理疗和透明质酸关节腔注射等，对于保守治疗无效的患者需要进行关节盘切除、关节盘置换和关节重建等手术进行治疗，但术后并发症和移植物使用寿命较短是目前面临的挑战[36]。采用dECM 修复或重建关节盘是治疗DP 的一种新的研究方向。有学者[37]通过冻融循环、酶和化学物质对猪颞下颌关节盘行脱细胞处理后再制备成猪颞下颌关节盘dECM 水凝胶并与支架材料复合，将载有大鼠肋软骨细胞和L929 成纤维细胞的支架体外培养，发现软骨细胞中SOX9 基因和Ⅱ型胶原纤维基因表达显著上调，体内实验进一步证明载有细胞的支架可以促进软骨组织形成。另有学者[38]用小肠粘膜下层dECM 经冻干、粉碎后制成一种与猪颞下颌关节盘大小和形状相近的支架，将该支架植入切除关节盘的猪动物模型中，发现其在术后3 月形成一种颞下颌关节盘样组织，该组织的主要成分和生物力学性能与天然关节盘相似。以上研究表明dECM 在促进颞下颌关节盘再生时具有重大应用价值，其不仅可以通过水凝胶形式进行关节腔内注射，还能作为支架材料加以应用。但目前对于dECM 在颞下颌关节盘再生中具体机制的研究还较少，相信未来通过不断研究可以将dECM 用于临床治疗，实现颞下颌关节盘的生理性修复。

5.神经

口腔颌面部外伤、手术等容易造成神经的损伤，其中下牙槽神经的损伤较常见，通常由牙槽外科手术、正颌外科手术以及颌骨手术等引起。对于大于8 mm 的较长神经缺损，修复的金标准是自体神经移植，但供体来源不足及供体区域的继发性功能障碍是目前面临的严峻挑战[39]。ANGs 作为一种天然支架，可通过神经组织经冻融、化学物质脱细胞处理获得。其不仅保留了天然神经的三维结构，而且去除了髓鞘、细胞等免疫源性物质，在诱导雪旺细胞（schwann cells，SCs）修复损伤神经中具有重要作用[40]。有研究[41]表明ANGs 可通过诱导脊髓中神经营养因子的高表达抑制JAK2/STAT3 信号通路促进神经再生。Shanti RM 等[42]对1 例下牙槽神经损伤的患者用同种异体ANGs进行修复，术后5月通过感觉检测和两点辨别感觉实验观察到患者患侧皮肤感觉功能恢复良好。但长段ANGs 移植可能会导致SCs 衰老进而使神经再生过程受到抑制[43]，提示选择合适的干细胞使ANGs 再细胞化或补充外源性物质以达到更为理想的修复效果是未来进一步的研究方向[44]。

6.牙再生

牙再生是指利用生物材料、种子细胞和生长因子模拟天然牙发生、发育过程中上皮和间充质的相互作用再生牙齿的过程[45]。有研究[46]在6 月大的猪颌骨中提取未萌出的钟状期牙胚进行脱细胞处理制成脱细胞牙胚，接种猪牙源性上皮细胞、人牙髓细胞和人脐静脉内皮细胞使脱细胞牙胚再细胞化，将其接种到猪的下颌骨中，术后6 月观察到由牙釉质、牙骨质、牙髓、牙本质和牙周膜组成的生物工程牙。这表明dECM 在牙再生过程中有巨大的作用，但其如何通过多种复杂的信号通路诱导牙再生仍不明确。此外，实现具有特定尺寸和形状的生物工程牙齿的再生及如何控制其萌出还需进一步研究。

四、讨论与展望

dECM 在口腔组织再生领域的应用是一个相对较新的课题，其在组织修复和再生中展现出了巨大的潜力。dECM 脱去了细胞及免疫成分，具有较低的免疫原性，这使异种来源的dECM 作为商业化产品用于口腔医学领域成为可能。其保留的生物活性物质可以诱导干细胞增殖和分化，调控细胞信号通路的传导和基因的表达，为干细胞移植和干细胞归巢策略用于口腔组织再生奠定了基础。组织、器官来源的dECM 可以直接作为支架材料用于口腔组织再生，但对于复杂的组织缺损无法实现精准修复，未来结合3D 打印技术制备出高精度的dECM 支架材料是一种发展趋势。细胞来源的dECM 力学性能较差，可以将其与生物相容性优良、可降解的高分子材料复合制备支架材料或将其涂覆于支架表面。但目前dECM 在应用中仍面临一些难题，例如：①脱细胞过程可能会破坏dECM 结构进而导致其有效成分的丢失；②其诱导不同口腔组织再生的具体机制尚未明确；③虽然目前关于dECM 的研究众多，但进入临床试验的还很少。综上所述，dECM 在口腔组织再生应用中充满了机遇和挑战，相信日后通过一系列的研究，可以解决dECM 现有的缺点，最终实现其在口腔组织再生中的广泛应用。