药物相关性颌骨骨坏死临床前模型建立的研究进展

陶 璐 高 颖 杨柳青 黄晗丹 李昱伸 喻锦铃 姚经经 刘志辉

双膦酸盐类药物（bisphosphonates，BPs）是治疗钙代谢障碍的一线药物，在临床上被广泛应用于治疗患有骨肿瘤、骨质疏松症、佩吉特氏病（Paget's Disease）、急性高钙血症、多发性骨髓瘤等疾病的患者[1]。2003 年，Marx 学者[2]首次提出，有BPs 治疗史的患者，在接受牙科手术后，出现颌骨暴露、感染、疼痛的症状，引起了广大医务工作者的关注。为了更好地规范疾病管理，2014 年美国口腔颌面外科医师协会（american association of oral and maxillofacial surgeons，AAOMS）提议[3,4]，结合患者的病史及临床检查，将满足以下条件并区别于其他形式的颌骨坏死，命名为“药物相关性颌骨骨坏死”（medication-related osteonecrosis of the jaw，MRONJ）：①正在或曾经单独使用过抗骨吸收剂（antiresorptive drugs，ARDs），或与免疫调节剂、抗血管生成剂（angiogenesis inhibitors，AgI）联合治疗；②颌面部持续存在8 周以上死骨暴露，或深达死骨的瘘管；③颌骨未经过放射治疗且无明显的颌骨转移性疾病。

动物实验是研究MRONJ发生机理的重要途径，动物模型可以模拟MRONJ 的发生、发展全过程，探索致病机制，检测防治措施的疗效。目前，通常采用全身性危险因素（如给予BPs 等药物），结合口腔局部危险因素的方法来诱导MRONJ的发生，建立标准化的体内实验模型。但由于MRONJ 的发病率不高（＜5%）[5，6]，临床前模型的建立具有一定的难度。理想的模型应能完全模拟人类MRONJ的临床特征，包括颌骨坏死、感染和创口暴露等，但是目前的MRONJ 临床前模型仅能模拟出部分病理生理学特征。本文从实验动物种类、全身性因素及口腔局部因素诱导方法等方面，对近年发表的MRONJ体内模型的建立方法进行综述，旨在为今后造模方法的选择提供参考。

一、实验动物

从2003 年至今，小型脊椎动物如大鼠（60%）、小鼠（27%）、稻鼠（2%）和兔（2%），及大型脊椎动物如犬（4%）、猪（3%）、绵羊（2%）等，已被运用于MRONJ 的研究[6]。笔者总结了近年来常见的MRONJ临床前模型的建模方式（表1）。可见现有建模手段多样，动物种类、药物种类、药物剂量、给药方式及局部诱导方式各有不同。

表1 已建立的MRONJ临床前模型

1.小型脊椎动物：如大鼠、小鼠等是MRONJ 建模最常使用的动物[19]。它们具有易于饲养、实验周期较短、成本低等普遍优势。且实验过程简单，不需要复杂的实验室设备及大量人力、物力资源。同时，较小体重的实验动物需要的药物量相对少，可以节约稀有或贵重试剂的使用量。

小鼠繁殖速度快，多见于基因工程的研究，有利于探索生物学机制[6]。但是，在长实验周期内（全身药物诱导+局部手术辅助诱导），大鼠较长的寿命比小鼠更有优势。另外，近年来新开发的稻鼠MRONJ模型无需机械干预、仅通过饮食调整便可诱发全口或局部性牙周炎，是研究牙周炎与MRONJ相关性的新兴得力新选择[20]。但是，小型脊椎动物口腔较小，在一定程度上限制了复杂的口腔手术操作，血液、龈沟液等体液及颌骨、牙周组织、器官等组织的样本收集量受到限制。同时，学者们普遍认为，鼠等啮齿类动物与大型脊椎动物不同，它们缺乏哈弗氏系统，在实验中不能完全模拟人类的皮质骨重塑[21]。且由于体型的限制，它们的药物代谢率与人类相差较远，使得药物剂量的推算比较困难。因此，小型脊椎动物模型存在一定的局限性。

2.大型脊椎动物：如比格犬、迷你猪、绵羊等的颌骨和牙齿较大，在一定程度上类似于人类。比格犬是最早用于MRONJ研究的动物之一，但目前尚未建立牙源性感染模型。另外，迷你猪具有非季节性发情、雌激素缺乏相关的骨质流失等特性[22]，其骨转换参数和口腔微生物种类与人类相似，是合适的MRONJ 实验动物[21，23]。绵羊与人类的骨愈合能力相当，在骨重塑与骨质疏松症的研究上具有一定潜力[24]。从人道主义出发，在实验可选择小型动物的情况下，应限制大型脊椎动物的使用。

二、全身性因素诱导法

1.药物诱导：临床前模型通过全身药物诱导来模拟患者的用药情况。其中，诱导途径包括腹腔、静脉、皮下或肌肉注射等。腹腔注射因操作简单而被广泛应用于啮齿动物模型。静脉注射是临床上最常用的给药方式。在建立动物模型时，静脉注射精度要求高、操作难度更大，但能起到最高的生物利用度，模拟临床情况、排除给药途径对实验结果造成的影响。诱导药物以BPs 和地诺单抗（denosumab,Dmab）为主，通常联合地塞米松（dexamethasone,Dex）或环磷酰胺（cyclophosphamide, CY），增加对动物骨重塑的抑制作用，但动物模型中的用药剂量尚未有统一的标准，为了在相对短的实验期内实现最大化的药物暴露，多倾向于应用癌症患者的用药剂量[25]。

双膦酸盐（BPs）：唑来膦酸（zoledronic acid,ZA）是临床上药效最强及最长的BPs，也是MRONJ建模中最常选择的药物[26]。多数动物模型按照人类治疗骨肿瘤的ZA 剂量（4 mg/60 Kg）给药。此外，Jabbour等[27]按照人类及其他物种之间等效表面积转换因子，计算得到SD 大鼠的ZA 剂量为0.13 mg/kg/周，Dex 为3.8 mg/kg/周，按此剂量注射，有90%的大鼠在拔牙术后出现了明显的骨暴露和炎症创口。由于鼠类的药物代谢率较快，还有部分研究选择了骨质疏松剂量的100 倍（0.2 mg/kg）作为药物剂量，从而确保阳性大鼠模型的成功建立[9]。

虽然与骨质疏松的治疗剂量相比，肿瘤的治疗剂量致病率更高，但是在动物模型中，MRONJ 的发病率并非与ZA 的剂量成正相关。Messer 等[28]发现，在接受0.02 mg/kg ZA 治疗的稻鼠中，MRONJ 的患病率为38%，然而0.125 mg/kg ZA 的患病率仅为26%。这些数据表明，患病率可能具有平台期，建模时不需过度加大用药剂量。

地诺单抗（Dmab）：Dmab 通过抑制核因子kappa-B 配体的受体激活剂（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）与核因子-κB 受体激活剂（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）结合，抑制破骨细胞从破骨前体细胞分化的级联反应，使得破骨细胞的存活率降低[29]。据报道，Dmab 相较于BPs 有更高的致病风险[30，31]。但是，Dmab 对动物RANKL 没有亲和力，其在动物模型中的应用是一项值得挑战的研究。学者们认为，在研究动物骨骼中RANKL 的抑制作用时，可以用与Dmab 相似程度的抗体来替换Dmab[13]。目前相关的动物模型较少，仅见于MRONJ与破骨细胞抑制的相关性实验中。Buranaphatthana 等[32]在裸鼠中使用10 mg/kg 剂量的抗小鼠RANKL 单克隆抗体来消耗破骨细胞，从而探究开发的iRANK 细胞与化学二聚化诱导剂（chemical inducer of dimerization，CID）治疗对拔牙窝内破骨细胞的形成作用。Williams 等[33]对C57BL/6 小鼠尾静脉注射0.25 mg 的抗小鼠RANKL 单克隆抗体，有50%发生了MRONJ，高于0.125 mg/kg 剂量的ZA 组（30%），他认为这是实验组完全抑制破骨细胞生成，而ZA组仅部分抑制的原因。结合临床上Dmab 更高的MRONJ 发病风险考虑，使用Dmab 治疗的患者应提高警惕。总之，与传统的ZA 药物诱导相比，Dmab 在此方面的研究仍旧空缺，期待更多学者的进一步探讨。

其他：ARDs相关的骨坏死已经在临床前模型中得到了广泛的研究，但是有关AgI 的研究却很有限，大多来自于病例报告和病例系列研究等。一般情况下，肿瘤患者会接受ARDs 及AgI 的联合治疗，研究者们很难单独分析AgI 与MRONJ 的关系，这促使研究者们将目光转向AgI 相关的动物模型上。已知，抗血管内皮生长因子A（antivascular endothelial growth factor A，VEGFA）单克隆抗体会缓解ZA 与环磷酰胺治疗的小鼠骨组织伤口愈合，但不会延缓软组织愈合[34]。在Messer 等[20]的研究中，与ZA 治疗诱发MRONJ 的稻鼠不同，给予抗VEGFA 单克隆抗体治疗的稻鼠没有发生MRONJ，而是在上、下颌骨中产生广泛的炎症反应，诱发破坏性的牙周炎，验证了先前的发现，对MRONJ的病因及病理生理学研究有重要意义。由于现有的研究样本量小、实验设计不够全面，AgI临床前模型能提供的指导意义有限。

Sakkas 等[35]报告一位使用托珠单抗（Tocilizumab）的患者，在拔牙后发生了MRONJ。同时，一些临床实践指南指出，Tocilizumab可降低新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）重症患者的死亡率，不少医院已经将其作为COVID-19 的治疗选择[36～38]。这提示在COVID-19大流行的背景下，应该注意Tocilizumab与MRONJ的相关性，它有望成为新的辅助建模药物。

2.药物诱导联合卵巢摘除术：已有不少研究通过卵巢摘除术来建立雌性动物骨质疏松模型[39]。在此基础上，学者们结合全身ARDs 治疗及口腔局部诱导，创建出基于骨质疏松的MRONJ 临床前模型，从而探讨骨质疏松症治疗剂量的ARDs 与MRONJ发生、发展的关系[10]。值得注意的是，Kubek[40]发现C3H 小鼠在卵巢摘除术后，下颌骨也出现了皮质骨重塑。这一发现弥补了啮齿类动物缺乏哈弗氏系统的不足，使得临床前模型的建立又多了一种选择。

三、口腔局部因素诱导法

服用药物的患者，通常在拔牙、种植等口腔侵入性操作后诱发MRONJ。因此，口腔局部因素的诱导对于动物模型的建立是必不可少的。

1.拔牙诱导法：拔牙已被认为是最重要的独立危险因素[2，3，42]。全身药物诱导结合牙拔除术在建模中也是最多见的组合。对于比格犬、迷你猪等大型脊椎动物，可使用牙钳或高速涡轮手机分冠后，再分别拔除牙根。但是，啮齿动物牙冠短小、牙根细长，普通拔牙器械无法夹持。Yu 等[43]使用尖锐的牙科探针楔入小鼠磨牙的根分叉，通过左右摇晃引导牙齿脱位。此外，拔牙过程中牙根的折断时有发生。有研究者将无法取出的断根保留在迷你猪的颌骨中[17，21]。但是Aguirre 等[6]认为，断根可能会导致实验结果受到影响，建议排除来自断根动物的数据。

由于下颌骨骨质致密、血管分布较少，MRONJ多发生于下颌[44,45]。所以对于比格犬、迷你猪等大型脊椎动物而言，多倾向于选择拔除下颌磨牙[6]。而啮齿类动物口腔较小，拔除下颌磨牙还需考虑舌头的阻挡，如果拔除上颌磨牙，操作时开阔的视野会大大降低手术难度，做到微创拔牙的同时还能减少牙根折断的可能性，有利于动物恢复摄食能力。

2.牙源性感染诱导法：在拔牙诱导模型中，通常拔除的是健康的牙齿，这可能无法完全模拟临床情况。有学者认为，部分MRONJ 的发生，是由病灶牙的慢性感染通过拔牙部位扩散而引起，并非拔牙本身所致[46]。此外，近期调查发现，牙源性炎症也可诱导MRONJ的发生[47]。为了解释牙源性炎症在MRONJ病理生理学中的致病作用，相应的感染模型被创建出来。拔除感染性牙齿的改良方法可呈现出更明显的MRONJ样病变，更接近临床实践中遇到的病变。

牙周炎诱导模型：Kim 等[48]在小鼠牙颈部放置了3 周的结扎丝以诱导牙周炎，与单独拔牙组相比，拔除具有牙周炎的牙齿会进一步增强骨坏死。移出结扎丝2 周后，牙龈的肿胀程度可见显著消退。由此说明病理性炎症状况会加剧MRONJ的发展，而炎症消退可改善症状。Gkouveris 等[49]在结扎1、2、4 周的小鼠观察到ZA 组与RANKL 抑制剂组结果相似，结扎区周围有炎症浸润，总血管面积显著减少，缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）增加，而新血管生成与炎症反应相关的信号级联减弱，展示了疾病的早期阶段向最终骨暴露的病理生理变化过程。这些动物模型无需拔牙，在避免破坏软组织完整性的同时，还能让黏膜和骨愈合的环境复杂化，从而允许研究MRONJ发生发展过程中的病理生理改变。

给稻鼠喂食高蔗糖酪蛋白饮食，可以在上下颌诱发全口牙周炎；而喂食标准啮齿动物食物，则可在上颌第二、三磨牙之间诱导出局部性牙周炎[20，28]。一般来说，实验室动物建模面临的挑战是如何诱导出牙周炎所致的MRONJ模型，而天生易患牙周炎的稻鼠面临的问题则是如何建立阴性模型。Castillo等[14]通过定期牙周维护、清洁龈沟内的食物残渣，以及用高水平的可溶性纤维代替标准啮齿动物食物中的不溶性纤维，从而控制了稻鼠局部牙周炎的发生，为消除稻鼠发生MRONJ 的口腔局部危险因素提供了新的方法。

根尖周病变诱导模型：一些病例报告提及MRONJ 由保守治疗的根尖周病变的病灶牙引发[50]。但其作为MRONJ危险因素的证据有限，需要动物模型进一步评估。Rao 等[41]给C57BL/6N 小鼠给予ZA后使用球钻钻开磨牙牙冠，从咬合面暴露牙髓组织，用小鼠自身的口腔菌群污染根管，以诱导根尖周病变。ZA 治疗虽然减少了根尖周疾病引起的牙槽骨吸收，但是却显着增加了骨细胞坏死、MRONJ 的发生几率。有研究指出，小鼠口腔内的本地共生菌群不会导致MRONJ 的发生，相反，长期使用广谱抗生素减少共生菌群的数量却可促进MRONJ 的发展[51]。另外，持续ZA 治疗可加剧大鼠根尖周炎症，使颌骨血液供应减少、无骨重塑并出现坏死区[52]。还有研究并未诱导根尖周病变，而是利用动物自身的自发性根尖周疾病进行实验。结果提示，经ZA 组与RANKL 抑制剂处理的动物，拔除根尖周病变的牙齿与拔除健康牙相比，病灶牙的拔牙窝暴露、骨愈合能力减弱，HE染色显示出更多的空骨细胞腔隙和骨坏死区域[53]。尽管如此，如今根尖周病变动物模型研究有限，其对MRONJ的影响尚未得到明确解释。

3.种植手术诱导法：种植手术被认为是MRONJ 的潜在局部危险因素[54，55]。大多数关于种植体周围骨骼重塑的动物研究都是使用胫骨或股骨等长骨进行的。可颌骨的生理特点及生长发育与其他骨骼不同，其转换率是长骨的10 倍，针对长骨的研究可能无法准确反映BPs对颌骨重塑的影响。临床方面的需求促使研究者们继续开发和改进动物模型，开始利用颌骨建立种植体模型。

Park 等[56]在对大鼠上颌第一磨牙即刻种植4 周后，皮下注射BPs，观察到BPs 组骨组织空腔隙数量随着注射时间的推移而显著增加，证实BPs 治疗可导致种植体周围骨重塑被抑制。Park等[10]在植入种植体后给予甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH），从而探究PTH 对负载BPs的上颌骨植入物周围骨骼重塑的刺激作用，是否可以逆转BPs 对骨骼的恶化效应。但是，由于目前的种植模型仍存在较大局限性，该类MORONJ 种植体植入动物模型的实验结果还可能需要更大的样本量及更长的给药时间来证实。探究触发MRONJ的机制。此外，颌骨对机械负荷水平敏感，在进一步研究中，应考虑在植入物和周围骨组织上施加咬合负荷，以模拟患者的口腔状况。