射干麻黄汤对支气管哮喘大鼠巨噬细胞活化及IL-21/STAT3通路调节作用研究

张凤凯,张宏丽,杨卫立

(1. 珠海市中西医结合医院,广东 珠海 519000;2. 珠海市香湾社区卫生服务中心,广东 珠海 519000)

支气管哮喘以慢性气道炎症及气道高反应性为主要临床特征,其发生与个体过敏体质等遗传因素、尘螨及空气污染等环境因素、病原体导致的呼吸系统感染等因素密切相关,且巨噬细胞活化与支气管哮喘的进展有关[1-3]。近年研究发现,白细胞介素(IL)-21/信号转导和转录活化因子3(STAT3)通路是与支气管哮喘发生发展密切相关的重要信号通路,该通路的异常激活是导致支气管哮喘发生及进展的关键因素[4]。目前西医主要采用糖皮质激素及β2受体激动剂治疗该病,但长期使用有一定不良反应,有些患者病情控制不满意,而中西医结合治疗支气管哮喘显示出一定优势。射干麻黄汤是经典名方,具有下气祛痰、温肺化饮之功效,既往实验证实该方可以通过抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-17的表达,减轻炎症反应,从而缓解哮喘大鼠气道重塑[5]。本实验基于巨噬细胞活化和IL-21/STAT3通路进一步探讨了射干麻黄汤治疗支气管哮喘的作用机制,以为射干麻黄汤的临床应用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠36只,6～8周龄,体重200～220 g,购自珠海百试通生物科技有限公司,实验动物许可证号:SCXK(粤)2020-0051。大鼠饲养于实验动物房,温度20～25 ℃,相对湿度40%～70%,明暗交替/12 h。实验动物的使用经珠海市中西医结合医院伦理委员会审查并批准(伦理审批号:20220114034)

1.2药品 射干麻黄汤由射干(批号:210913)9 g、细辛(批号:220810)9 g、紫菀(批号:220325)9 g、款冬花(批号:211029)9 g、麻黄(批号:210918)12 g、五味子(批号:220420)12 g、生姜(批号:210716)12 g、半夏(批号:211115)12 g、大枣(批号:220525)15 g组成,中药饮片购自北京同仁堂药业公司,将饮片置于1 500 mL蒸馏水中浸泡1 h,煎煮40 min,过滤,留滤液,将药材残渣置于1 000 mL蒸馏水中再次煎煮30 min,过滤,留滤液,合并两次滤液,加热蒸发浓缩,制成生药含量为0.5 g/mL的制剂备用。地塞米松片为天津力生制药股份有限公司产品,批号:210911。卵清白蛋白(OVA)致敏液由1 mL生理盐水、10 mg OVA(翌圣生物科技股份有限公司,货号:36121ES60)100 mg氢氧化铝(北京索莱宝科技有限公司,货号:A7130)配置而成。

1.3试剂及仪器设备 干扰素-γ(IFN-γ)ELISA试剂盒(北京孚博生物科技有限公司,货号:EIA4583) ,IL-2 、IL-4、IL-13 ELISA试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司,货号分别为PI577,PI615,ER0034) ,HE染色试剂盒、山羊抗兔二抗、F4/80兔单克隆抗体、免疫组化试剂盒(碧云天生物科技有限公司,货号分别为C0105S,A0277,AG4753,P0625); Diff-quick染液(上海钰博生物科技有限公司,货号:ES60);组织裂解液、化学发光液、磷酸盐缓冲液(PBS)、蛋白含量测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号分别为R0010,PE0010,P1020,PC0020);GAPDH、IL-21、p-STAT3、STAT3兔抗体(赛默飞世尔科技公司,货号分别为PA1-988,PA5-115407,MA5-41116,PA5-17876)。V100呼吸机(上海玉研科学仪器有限公司),Gel Doc EZ凝胶成像仪(伯乐生命医学产品有限公司),Allegra X-15R台式冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司),M2e酶标仪(美谷分子仪器有限公司),DM IRB荧光倒置显微镜(徕卡显微系统公司)。

1.4实验方法 随机选取6只大鼠作为正常组,其余大鼠参照文献[6]方法使用OVA建立支气管哮喘模型:于造模开始第1天及第8天腹腔注射OVA致敏液,造模第15天将大鼠置于密闭容器内雾化吸入1% OVA溶液,30 min/次,隔天1次,连续吸入56 d后,以大鼠出现呼吸急促、挠鼻、鼻腔透明分泌物、点头样呼吸视为造模成功。将造模成功大鼠随机分为哮喘组、地塞米松组及射干麻黄汤低、中、高剂量组,每组6只。 射干麻黄汤低、中、高剂量组大鼠分别给予射干麻黄汤1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg(参考文献[5]计算给药剂量,以生药含量计)灌胃,地塞米松组大鼠给予地塞米松1 mg/kg(参考文献[7]计算给药剂量)灌胃,正常组及哮喘组灌胃等量蒸馏水,均1次/d,连续灌胃20 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1肺功能 末次灌胃结束后24 h,腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠,仰卧位固定后行气管切开并连接呼吸机,使用肺功能检测系统测定肺活量、肺动态顺应性及呼气峰值流速。

1.5.2肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平 肺功能测定结束后行气管插管,使用4 ℃预冷的PBS 1 mL灌洗大鼠双肺,收集肺泡灌洗液,每只大鼠重复3次。将肺泡灌洗液置于离心机,4 ℃下3 500 r/min离心10 min, 取上清,使用ELISA试剂盒测定IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平。

1.5.3肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比 收集肺泡灌洗液离心后的沉淀物,使用Diff-quick染液染色后置于光学显微镜下观察,计算嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比。

1.5.4肺组织病理学形态 颈椎脱臼法处死大鼠后分离肺组织,置于4%中性甲醛中固定24 h,石蜡包埋后制成4 μm切片,常规HE染色后,置于显微镜下观察拍照。

1.5.5肺组织中F4/80蛋白阳性表达情况 采用免疫组化法检测:取制备好的肺组织石蜡切片,经脱蜡、水化后,封闭内源性过氧化物酶及抗原修复后,按照免疫组化试剂盒方法,使用F4/80兔单克隆抗体(1∶500稀释)室温孵育1 h,使用PBS清洗5次,加入生物素标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀释),37 ℃孵育30 min,PBS清洗5次,DAB着色后,使用苏木精复染,依次经脱水、透明处理,中性树脂封片,置于显微镜下拍照,使用Image-pro plus 8.0软件测定F4/80蛋白阳性表达积分光密度。相对积分光密度=实验组积分光密度/正常组积分光密度。

1.5.6肺组织中IL-21、p-STAT3、STAT3蛋白表达情况 取低温保存肺组织,使用组织裂解液裂解匀浆后,4 ℃下8 000 r/min离心10 min,取上清,使用蛋白含量测定试剂盒测定总蛋白含量,取蛋白含量为40 μg的上清液,依次经电泳分离、转膜后,使用5%的脱脂牛奶室温封闭1 h,加入GAPDH、IL-21、p-STAT3、STAT3兔抗体(1∶500稀释)4 ℃孵育过夜,PBS清洗3次,使用山羊抗兔二抗(1∶1 000稀释)室温孵育1 h,PBS清洗3次,化学发光液显影后,置于凝胶成像系统成像并拍照,以GAPDH为内参,计算IL-21蛋白相对表达量及p-STAT3/ STAT3比值。

2 结 果

2.1各组大鼠肺活量、肺动态顺应性及呼气峰值流速比较 哮喘组大鼠肺活量、肺动态顺应性及呼气峰值流速均明显低于正常组(P均<0.05);射干麻黄汤各组及地塞米松组大鼠肺活量、肺动态顺应性及呼气峰值流速均明显高于哮喘组(P均<0.05);射干麻黄汤各组大鼠肺活量、肺动态顺应性及呼气峰值流速随着射干麻黄汤剂量的增加而逐渐升高,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05);射干麻黄汤高剂量组大鼠肺活量、肺动态顺应性及呼气峰值流速与地塞米松组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和哮喘各组大鼠肺活量、肺动态顺应性及呼气峰值流速比较

2.2各组大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平比较 与正常组比较,哮喘组大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2水平均明显降低(P均<0.05),IL-4、IL-13水平均明显升高(P均<0.05);与哮喘组比较,射干麻黄汤各组及地塞米松组大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2水平均明显升高(P均<0.05),IL-4、IL-13水平均明显降低(P均<0.05);射干麻黄汤各组随着射干麻黄汤剂量的增加,肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2水平逐渐升高,IL-4、IL-13水平逐渐降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05);射干麻黄汤高剂量组大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平与地塞米松组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和哮喘各组大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-13水平比较

2.3各组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比比较 哮喘组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比均明显高于正常组(P<0.05);射干麻黄汤各组及地塞米松组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比均明显低于哮喘组(P均<0.05);射干麻黄汤各组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比随着射干麻黄汤剂量的增加而逐渐降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05);射干麻黄汤高剂量组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比与地塞米松组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 正常组和哮喘各组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞及中性粒细胞占比比较

2.4各组大鼠肺组织病理学形态 正常组大鼠肺组织正常;哮喘组大鼠肺组织气管壁增厚,肺组织炎症损伤;与哮喘组比较,射干麻黄汤各组及地塞米松组大鼠肺组织病变明显减轻。见图1。

图1 正常组和哮喘各组大鼠肺组织病理学形态(HE, ×200)

2.5各组大鼠肺组织中F4/80蛋白阳性表达情况比较 正常组大鼠肺组织中仅有少量F4/80蛋白表达,哮喘组大鼠肺组织中F4/80蛋白表达明显增多,哮喘组大鼠F4/80蛋白阳性表达相对积分光密度为27.67±2.52,明显高于正常组的1.00±0.00(P<0.05); 射干麻黄汤低、中、高剂量组及地塞米松组大鼠肺组织中F4/80蛋白表达有所减少,相对积分光密度分别为18.27±0.67,13.67±2.08,3.03±1.06,8.33±1.52,均明显低于哮喘组(P均<0.05);射干麻黄汤各组大鼠肺组织中F4/80蛋白阳性表达相对积分光密度随着射干麻黄汤剂量的增加而逐渐降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05);射干麻黄汤高剂量组与地塞米松组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 正常组和哮喘各组大鼠肺组织中F4/80蛋白阳性表达情况(免疫组化染色,×200)

2.6各组大鼠肺组织中IL-21、p-STAT3、STAT3蛋白表达情况比较 哮喘组大鼠肺组织中IL-21蛋白相对表达量及p-STAT3/STAT3比值均明显高于正常组(P均<0.05);射干麻黄汤各组及地塞米松组大鼠肺组织中IL-21蛋白相对表达量及p-STAT3/STAT3比值均明显低于哮喘组(P均<0.05);射干麻黄汤各组大鼠肺组织中IL-21蛋白相对表达量及p-STAT3/STAT3比值随着射干麻黄汤剂量的增加而逐渐降低,两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05);射干麻黄汤高剂量组大鼠肺组织中IL-21蛋白相对表达量及p-STAT3/STAT3比值与地塞米松组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

图3 正常组和哮喘各组大鼠肺组织中IL-21、p-STAT3蛋白表达情况

3 讨 论

支气管哮喘是临床中常见的呼吸系统疾病,目前尚无法根治。近些年的研究显示,射干麻黄汤可有效治疗该病,如何蕊等[8]研究发现射干麻黄汤能够显著缓解支气管哮喘患者临床症状,减轻机体炎症反应;王坤等[9]研究发现加味射干麻黄汤能够改善支气管哮喘患者的肺功能,减轻炎症反应,减少哮喘发作;左琳等[10]研究证实,加味射干麻黄汤能够显著提高孟鲁司特钠对支气管哮喘的治疗效果,缩短患者气短、呼吸困难的缓解时间。本实验结果显示,射干麻黄汤可明显改善支气管哮喘大鼠的肺功能,与临床研究结果一致。气道炎症反应是支气管哮喘的重要特征,INF-γ、IL-2、IL-4、IL-13等炎症因子及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞均参与气道炎症的发生发展[7,11-13]。管泱等[11]研究证实,降低IL-4水平、升高INF-γ水平能够显著促进肺功能的恢复,抑制哮喘发作。孟玲玉等[14]报道,减少嗜酸性粒细胞在肺组织中的浸润,促进嗜酸性粒细胞凋亡,有利于减轻哮喘大鼠气道炎性反应。本实验结果显示,哮喘大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-2水平均明显降低,IL-4、IL-13水平和嗜酸性粒细胞、中性粒细胞占比均明显升高,肺组织发生炎性损伤;而射干麻黄汤能够呈剂量依赖性显著升高IFN-γ、IL-2水平,降低IL-4、IL-13水平和嗜酸性粒细胞、中性粒细胞占比,进而抑制支气管哮喘大鼠气道炎症反应,减轻肺组织病变。

巨噬细胞活化与支气管哮喘患者的肺功能及病情进展密切相关,调节巨噬细胞活化状态可能是治疗支气管哮喘的有效途径[15-16]。F4/80蛋白是反映巨噬细胞活化的重要标志物,肖愉箫等[17]研究证实其在咳嗽变异性哮喘小鼠肺组织中表达增加。本实验中哮喘大鼠肺组织中F4/80蛋白阳性表达相对积分光密度明显升高,说明支气管哮喘大鼠发生巨噬细胞活化;射干麻黄汤各组大鼠肺组织中F4/80蛋白阳性表达相对积分光密度明显降低,提示射干麻黄汤能够抑制巨噬细胞活化。

IL-21/STAT3通路是近年来研究发现的与支气管哮喘发生、发展密切相关的重要信号通路。 伍爽等[4]研究表明,哮喘大鼠肺组织中IL-21、p-STAT3蛋白表达明显上调,而下调二者表达能够显著抑制哮喘大鼠气道炎症,修复肺组织病变。杜明红等[18]临床研究证实,支气管哮喘患者体内STAT3蛋白表达水平升高,且与气道炎症程度呈正相关。王莹巍等[19]研究证实,抑制哮喘幼鼠肺组织中STAT3蛋白表达能够明显减轻气道炎症。 本实验结果显示,哮喘组大鼠肺组织中IL-21蛋白相对表达量及p-STAT3/ STAT3比值均明显高于正常组,射干麻黄汤各组大鼠肺组织中IL-21蛋白相对表达量及p-STAT3/ STAT3比值均明显低于哮喘组。提示射干麻黄汤能够抑制支气管哮喘大鼠IL-21/STAT3通路激活,进而显著抑制气道炎症反应。

综上所述,射干麻黄汤可有效改善支气管哮喘大鼠肺功能,减轻气道炎症反应,机制可能与抑制肺组织巨噬细胞活化、调节IL-21/STAT3通路有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。