TNIP1基因单核苷酸多态性及其mRNA表达水平与老年慢性心力衰竭患者肺部感染的相关性分析

许 潇, 徐华娟, 李 洺, 严姝瑛, 高凤英, 陈慧琳

(上海建工医院1重症医学科, 2呼吸科, 上海 200083)

肺部感染是老年慢性心力衰竭患者最常见的并发症,且会进一步加重患者心脏负担,对患者预后造成不良影响[1]。然而,肺部感染的早期临床症状不明显,诊断困难,为早期治疗造成了困难。因此,寻找老年慢性衰竭患者发生肺部感染的高危因素,对尽早识别高危人群并采取预防手段,从而改善患者预后具有重要意义。患者免疫功能低下是受到细菌侵袭及感染的重要危险因素[2]。肿瘤坏死因子诱导蛋白3相互作用蛋白1(TNFAIP3-interacting protein 1,TNIP1)基因表达的蛋白产物是一种多泛素结合蛋白,是一种维持机体免疫稳态的重要物质[3]。TNIP1表达升高可引起B细胞反应减弱、血清免疫球蛋白含量降低和自身抗体水平下降[4]。研究表明,个体的TNIP1水平有差异,这种差异可能是由于基因单核苷酸变异导致的[5]。基于此,本研究旨在探讨老年慢性心力衰竭肺部感染患者的TNIP1基因单核苷酸多态性及其表达水平,以期为预防老年慢性心力衰竭肺部感染及早期干预提供新的思路和方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2019年10月至2022年10月于上海建工医院重症医学科就诊的130例老年慢性心力衰竭患者作为研究对象。依据《医院感染诊断标准(2001)》对肺部感染进行诊断,参照《全国临床检验操作规程》对病原菌进行鉴定,根据是否于院内发生肺部感染分为肺部感染组和未感染组。纳入标准:(1)年龄≥65周岁;(2)符合《2016年欧洲心脏病学会急慢性心力衰竭诊断与治疗指南》中慢性心力衰竭诊断标准;(3)临床和实验室资料完整;(4)住院前及住院48 h内未发生急、慢性感染。排除标准:(1)合并严重肝、肾功能不全或恶性肿瘤;(2)患有血液系统疾病、内分泌疾病或自身免疫性疾病;(3)入院前3个月使用激素类药物;(4)入院前即出现感染灶。本研究通过医院伦理委员会审查批准(审批号:JGYYLL-2019001),所有患者或家属均自愿参与研究,并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料的收集 包括研究对象的性别、年龄、BMI、病因、心功能分级和有无吸烟、饮酒史等情况。

1.2.2 TNIP1基因多态性的检测 患者住院当天采集2 mL外周静脉血,置EDTA抗凝管中,-80℃冷冻保存。应用Nanodrop2000对所提取的基因组DNA浓度进行测定,并在-20℃条件下冷冻放置。确定TNIP1基因的两个SNP位点rs6889239(T>C)、 rs17728338(A>G), 然后应用毛细管电泳和片段分析(SNaPshot)技术对其进行基因分型。由上海天昊公司设计及提供引物,引物序列如下。rs6889239:F,5′-CCCTCGCTTATCTGGTCTGT-3′;R,5′-AAGGATTGCCCAAGGTCAGA-3′;扩增产物长度为98 bp。rs17728338:F,5′-GTAAAATTTGTGGTTCAGC-3′;R,5′-TGGAAGGGTGCAAGCAGTT-3′;扩增产物长度为102 bp。采用三步法进行PCR扩增反应:首先,在95℃条件下预变性5 min;然后,于95℃条件下变性10 s,再在55℃条件下退火30 s,于72℃条件下延伸45 s,总共扩增35个循环。PCR扩增产物的完整性使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 TNIP1基因mRNA表达水平的检测 入院当天采集患者的外周静脉血2 mL,采用Ficoll密度分离法分离患者外周血单核细胞,依据Trizol试剂盒说明书提取总RNA,逆转录合成cDNA,进行定量实时荧光定量聚合酶链式反应。TNIP1基因的引物序列:F,5′-CCAAGACCCTGAACTACGCA-3′;R,5′-CCCAACTACTTCCCCCATCT-3′。内参基因β-actin的引物序列:F,5′-TCCGCGCTACTGTCTTCTCT-3′;R,5′-TCGTGACGAGTAATCCTA-3′。首先,于94℃条件下预变性10 min;其次,95℃条件下变性15 s,于60℃条件下退火30 s;最后,75℃条件下延伸1 min,共进行40次循环。反应结束后应用标准曲线法对所得数据进行相对定量分析,采用2-ΔΔCt法对结果进行计算。

2 结果

2.1 感染组和未感染组一般资料比较130例患者中32例患者发生肺部感染,98例患者未发生肺部感染。感染组与未感染组患者的一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 感染组和未感染组一般资料的比较

2.2 感染组和未感染组TNIP1基因型分布及等位基因频率比较TNIP1基因rs6889239位点在感染组和非感染组之间的基因型分布以及等位基因频率的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 感染组和未感染组TNIP1基因型分布及基因频率的比较

2.3 感染组和未感染组外周血TNIP1基因表达水平的比较感染组外周血TNIP1基因mRNA表达水平为2.34±0.34,显著高于未感染组患者1.79±0.23,差异有统计学意义(t=4.225,P<0.001)。

2.4 外周血TNIP1基因表达水平预测肺部感染的价值分析ROC曲线分析结果显示,外周血TNIP1基因表达水平预测慢性心力衰竭患者发生肺部感染的曲线下面积为0.887[(95%CI=0.803～0.972),P<0.001],截断值为2.11,灵敏度和特异度分别为71.9%和95.9%,见图1。

图1 外周血TNIP1基因表达水平预测肺部感染的ROC曲线

2.5 TNIP1基因多态性对基因表达水平的影响感染组和非感染组TNIP1基因rs6889239位点不同基因型患者的外周血TNIP1基因的表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05),而rs17728338位点不同基因型患者的外周血TNIP1基因表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 TNIP1基因多态性对基因表达水平的影响

3 讨论

慢性心力衰竭患者由于心脏结构异常和功能不全容易导致呼吸功能障碍;老年慢性心力衰竭患者由于机体免疫力降低,体内菌群稳态减弱,更容易发生肺部感染[6-9]。TNIP1是维持机体免疫功能的重要物质,且其表达水平可能与基因变异有关[10]。本研究发现TNIP1基因rs17728338变异与老年慢性心力衰竭患者肺部感染的发生有关,随着rs17728338位点突变型等位基因频率的升高,患者发生肺部感染的风险增大。此外,感染组外周血TNIP1基因mRNA表达水平显著高于未感染组患者,并且发生TNIP1基因rs17728338位点变异的老年慢性心力衰竭患者基因表达水平升高,发生肺部感染的风险增大。

TNIP1基因位于5号染色体上,rs6889239和rs17728338位点位于该基因第一个内含子区,已被证实与疾病的发生、发展机制有关[11-13]。研究表明,TNIP1基因rs6889239位点中的C等位基因与系统性红斑狼疮患者肾脏受累发生率和类风湿性关节炎患者较低的发病年龄有关[4];TNIP1 基因rs17728338 G等位基因与症状性人类呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)感染和婴儿毛细支气管炎的发生概率降低有关[10];TNIP1基因rs17728338多态性与牛皮癣易感性显著相关[14]。提示TNIP1多态性可能影响对HRSV疾病的易感性。

本研究ROC曲线分析结果显示,外周血TNIP1基因表达水平对预测慢性心力衰竭患者发生肺部感染特异度较好,但灵敏度较低。提示,外周血TNIP1基因表达水平预测慢性心力衰竭患者是否发生肺部感染可能存在一定的漏诊风险。此外,随着突变等位基因G频率的增加,患者外周血TNIP1基因表达水平随之升高,这一结果提示TNIP1基因rs17728338位点变异可能会影响基因表达水平。邱新峰等[15]研究也证实基因单核苷酸多态性与基因表达水平密切相关。

综上所述,TNIP1基因rs17728338位点变异及基因表达水平与老年慢性心力衰竭患者发生肺部感染有关。