空间转录组技术在子宫内膜异位症免疫微环境研究中的应用前景

许泽玫红，杨如玉，吴琼，吕艺，梁炎春

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种雌激素依赖性常见妇科疾病，表现为子宫内膜组织种植于子宫被覆黏膜及子宫肌层以外部位。EMs 是一种慢性疾病，影响到全球大约10%（2 亿）的育龄妇女，且30%～50%的EMs 女性不孕[1-2]，严重影响患者的生活质量。EMs 虽为良性疾病，却有着恶性疾病的行为学特征[3]，免疫因素在其发病中发挥重要作用。EMs 患者盆腹腔免疫微环境中存在类似于肿瘤样的炎性改变[4]，巨噬细胞吞噬能力下降，细胞毒性T 细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞杀伤作用降低，逆流的内膜组织或细胞从免疫清除中逃逸，在盆腹腔中种植生长，形成异位病灶，盆腹腔的慢性炎症环境也促进了病灶的进一步进展[5]。多维度分析免疫微环境改变有助于理解EMs 的发生发展机制，从而实现早期诊断和有效治疗的目标。2020 年“空间转录组技术”被《自然－方法》（Nature Methods）评为年度技术方法，此项技术可揭示各细胞类型在组织中的空间分布以及各细胞群体间的相互作用，并可以用于绘制不同组织区域的基因表达图谱，对理解疾病的发生机制具有深远价值[6]。现主要阐述空间转录组技术在探究EMs 免疫微环境改变上的应用前景，为研究EMs 发病机制提供新的科学工具。

1 EMs 免疫微环境的构成

EMs 有着独特的类肿瘤表现，本文所述微环境参照肿瘤微环境，包括EMs 病灶及周围的免疫细胞、血管神经、信号分子及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等多种微环境组分。肿瘤细胞所处的内环境即肿瘤微环境，具有缺氧、免疫抑制和慢性炎症等特点，能够引起一系列异常的生理生化现象，导致肿瘤的发生发展[7]。类比肿瘤微环境，EMs 免疫微环境由非细胞成分与细胞成分共同构成。在非细胞成分中，多种细胞因子、驱化因子以及炎症介质都被证实与子宫内膜异位病灶的发生发展有关。研究表明，与正常组织相比，异位子宫内膜组织中溶解ECM 的蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），呈现高表达模式[8-11]。MMP-9 在腹腔环境中的高表达有助于异位内膜生长，COX-2 在缺氧条件下促进炎症发展并且是EMs 患者发生痛经的主要原因，TGF-β 增强内膜间质细胞的侵袭和迁移能力，从而促进病灶向组织深层侵袭。在细胞成分中，巨噬细胞、NK 细胞和T 淋巴细胞是免疫微环境的主导部分，发挥着更为重要的作用。

2 空间转录组技术在免疫微环境巨噬细胞研究中的应用前景

2.1 巨噬细胞在EMs 发生发展中的作用巨噬细胞在EMs 的发生发展中起到重要作用，巨噬细胞对机体局部微环境产生反应，可根据局部环境因素改变自身转录组和表型。Mills 等[12]观察显示，小鼠腹腔中来自辅助性T 细胞1（Th1）的巨噬细胞经γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）或脂多糖刺激后产生的一氧化氮比来自Th2 的巨噬细胞多，由此将巨噬细胞分为M1 型巨噬细胞和M2 型巨噬细胞。M1 型巨噬细胞与炎症发生相关，并可分泌促炎细胞因子如白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 等，而M2 型巨噬细胞发挥抗炎作用，参与组织重塑和血管形成[13-14]。不同表型的巨噬细胞均参与EMs 病灶的血管生成、损伤修复及神经新生等。Bacci 等[15]研究发现在EMs的小鼠模型中，诱导巨噬细胞向促炎M1 型转化可以抑制异位病灶生长，而向M2 型转化的巨噬细胞作用与之相反，可促进病变的生长。近年来国内研究均提示EMs 患者内膜中M2 型巨噬细胞数量显著增加，且腹腔和病灶中的M2 型巨噬细胞可能通过促进神经纤维生长而导致EMs 患者的疼痛[16-17]。也有研究表明EMs 患者的腹腔液中巨噬细胞及相关细胞因子数量增加，但吞噬能力下降[18]，从而为异位内膜病灶的定植及侵袭浸润提供免疫条件。

2.2 空间转录组技术在巨噬细胞研究上的应用前景巨噬细胞在一些疾病（如EMs）的发展过程中通常会发生强烈的转录组学变化，空间转录组技术提供的基因表达的空间位置信息能够用于建立组织细胞的空间图谱，在探究巨噬细胞转录组学变化以及寻找新的治疗靶点方面有着广阔前景。Tang 等[19]在单细胞和空间转录组视角下研究狼疮性肾炎的免疫环境和巨噬细胞的关键作用，阐明了引发自身免疫反应的潜在上游巨噬细胞，发现狼疮性肾炎患者肾脏中淋巴管生成促使巨噬细胞的运输，通过单细胞和空间转录组分析狼疮性肾炎肾脏的局部免疫反应有助于研究潜在的治疗靶点。Margaroli 等[20]在新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）、甲型流感和双重感染者肺组织中利用空间转录组技术分析了感兴趣区域的1 860 个基因，其中肺巨噬细胞中增强的基因特征表明，新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）中巨噬细胞替代性活化增加，此研究通过空间转录组技术揭示了SARS-CoV-2 中与组织损伤/重塑、细胞表型改变和血管损伤有关的区域转录变化，并提出了COVID-19 相关急性呼吸窘迫综合征的治疗目标。利用高空间分辨率的转录组学技术研究免疫微环境中巨噬细胞的动态变化有助于深入理解疾病机制。巨噬细胞的募集及其在子宫内膜异位病灶内的极化表型已被证明有助于EMs 的发展和维持[21-22]，空间转录组技术为巨噬细胞不同亚型和激活状态的深层表型分析提供了新的有力的工具，为揭示EMs 巨噬细胞的动态变化和靶向治疗提供了巨大希望。

3 空间转录组技术在免疫微环境NK 细胞研究中的应用前景

3.1 NK 细胞在EMs 发生发展中的作用目前EMs的病因及病理机制尚不清楚，相对主流的学说为经血逆流和种植理论[23]。根据经血逆流学说，脱落的内膜细胞随经血逆流至腹腔中形成异位病灶，而这些细胞得以在腹腔中种植，可能依赖于NK 细胞的免疫清除功能失调。NK 细胞是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。研究已证实异位子宫内膜细胞能降低NK细胞的活性，且异位子宫内膜对NK 细胞具有更强的抵抗能力[24]。Abomaray 等[25]研究了子宫内膜异位病灶中间充质细胞对NK 细胞功能的影响，结果显示异位病灶中的间充质细胞可能不会通过其对NK 细胞的抑制作用来减少EMs 的免疫监视。而Yang 等[26]研究发现子宫内膜基质细胞和巨噬细胞之间的串扰通过分泌IL-10 和TGF-β 来减弱NK 细胞的毒性，进而触发异位片段的免疫逃逸。NK 细胞的变化及其导致子宫内膜细胞免疫逃逸的具体机制还需进一步探索。

3.2 空间转录组技术在NK 细胞研究上的应用前景现有的空间转录组技术主要分为两大类，一类是基于原位捕获和测序的方法，核心是利用具有空间位置信息的DNA 标签引物捕获并标记转录本的空间位置信息；另一类是基于成像的方法，核心是在RNA 的原始位置对其染色编码从而实现多重检测。Lamarthée 等[27]研究对来自16 个肾移植活检组织的35 152 个转录组进行测序和鉴定，探究细胞组成和细胞间的相互作用，发现受者来源的Fcγ 受体Ⅲa（Fc fragment of IgG receptor Ⅲa，FCGR3A）阳性单核细胞、FCGR3A+NK 细胞与移植肾内炎症的严重程度之间存在特定联系。活化的FCGR3A+单核细胞过表达CD47 和白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte Ig-like receptor，LILR）基因，增加旁分泌信号通路，促进T 细胞浸润旁分泌信号通路。FCGR3A+NK 细胞分析显示FC 受体样蛋白3（Fcreceptor-likeprotein3，FCRL3）过表达，揭示抗体依赖性细胞毒性是NK 细胞介导移植物损伤的核心机制。同时Lamarthée 等[27]在18 张独立的活检切片上使用38 个标志物进行多重免疫荧光，证实了FCGR3A+NK 细胞和FCGR3A+非典型单核细胞在抗体介导的排斥反应中的作用，这种作用对肾小球区域具有特异性。这些结果突显了先天性免疫细胞在异体移植排斥反应发病机制中的核心参与作用，并确定了几个可能改善异体移植物寿命的潜在治疗靶点，空间转录组技术在其中发挥不可替代的作用。EMs 是一种与局部和全身免疫反应相关的慢性炎症性疾病，异位子宫内膜与在位子宫内膜微环境显著不同，NK 细胞是免疫系统信息传递的重要媒介之一，可决定异位内膜的生物特性，包括植入黏附、增殖侵袭和免疫逃避等利于异位内膜生长的条件[28-29]。利用基于测序与基于成像的空间转录组技术获得微环境中NK 细胞的空间位置信息，可以进一步探究NK 细胞为EMs 的发生发展创造的局部免疫条件。

4 空间转录组技术在免疫微环境T 细胞研究中的应用前景

4.1 T 细胞在EMs 发生发展中的作用T 细胞由胸腺内淋巴干细胞分化而来，是淋巴细胞中数量最多、功能最复杂的一类细胞。T 细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类，T 细胞失调在EMs 的发生发展中起重要作用，其中Th17/调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）平衡和Th1/Th2 平衡对维持免疫内稳态和炎症持续性作用至关重要。相关研究发现，晚期EMs 患者腹腔液中的CD4+CD25+FoxP3+Treg 细胞表达水平显著高于早期EMs 患者或健康对照者[30]，提示Treg 改变可促进异位子宫内膜的存活和植入。同时也有研究表明，耗竭Treg 可通过抑制TGF-β1/ Sma 和Mad 相关蛋白3（Smaand Mad-related protein 3，Smad3）和血小板衍生生长因子受体-β（platelet-derived growth factor receptorβ，PDGFR-β）/磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路，减缓了病灶的进展和纤维形成[31]，提示Treg也可能参与EMs 病灶的纤维化进程。Th17 被认为是一种促炎性T 细胞亚群，抑制EMs 病变的进展[32]。而研究发现EMs 患者的Th17 的细胞数量显著低于正常人，伴有巨噬细胞信号传导/激活相关的基因表达异常[33]。Th1 也被认为与促炎细胞因子相关，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IFN-γ、IL-1β 等，而Th2 免疫细胞在IL-4、IL-6 和IL-13 的升高中起主要作用[34]。研究发现EMs 患者的Th1 向Th2 漂移，可导致局部免疫抑制，从而促进异位内膜的黏附、侵袭、血管生成等一列生物学过程[35]。

4.2 空间转录组技术在T 细胞研究上的应用前景研究病灶异质性和微环境需要高分辨率技术，空间转录组技术是研究多种细胞类型之间的相互作用以及这些细胞的空间连接的新技术。此项技术已应用于研究细胞空间分布和肿瘤微环境在乳腺癌进展中的重要作用，Mao 等[36]采用10X Genomics Visium的空间转录组技术揭示乳腺癌病灶的空间异质性，通过细胞共位和相互作用构建肿瘤微环境的景观，发现T 细胞与肿瘤细胞表现出高度的共位，也是信号应答性最大的细胞。尤其是活化的CD8 细胞比静息CD8 细胞表现出更高的肿瘤空间特异性，而诱导免疫缺陷的细胞群的肿瘤空间特异性较低，如Treg，这项研究为开发个性化T 细胞受体工程化T 细胞疗法（T-cell receptor engineered T cell therapy，TCR-T）提供希望。EMs 微环境类似于肿瘤微环境，将空间转录组技术用于EMs，不仅可以将微环境作为整体显示出来，还可以通过测序等技术对不同类型的细胞进行定位，这将会提高我们对T 细胞与其他细胞之间的交互作用以及T 细胞在参与构建免疫抑制环境上的认识。

5 结语与展望

空间转录组技术是一项具有高空间分辨率的新技术，已在神经生物学、发育生物学、肿瘤生物学等领域有所应用，其具有多种技术解决方案且能够提供不同精度的基因表达空间信息，为EMs 免疫微环境的研究奠定了基础并描绘了灿烂前景。未来，空间转录组学与其他组学技术以及生信分析相结合，描绘免疫微环境整体图景、鉴定免疫微环境中多种细胞类型、探究免疫细胞在微环境中的动态发展和空间特异性，有助于进一步明确EMs 免疫微环境的构建机制，为及早发现与发病密切相关的基因改变，探究新的治疗靶点提供新思路和新技术。若能进一步解决成本高和费用高的问题，空间转录组技术或将广泛用于临床，指导EMs 的风险预警、早期筛查、早期诊断和精准治疗。