阻滞腺苷A2A受体抑制胶质瘤细胞干性特征并诱导保护性自噬

邓国棋 盛强 邵云香 杨岩 张勖 徐敬轩

【摘要】目的探究阻滞腺苷A2A受体（A2AR）对胶质瘤细胞干性特征与保护性自噬的影响。方法将人胶质瘤U87细胞分为四组：对照组、shNC组、shA2AR组、SCH58261组，分别将shNC、shA2AR转染至shNC组与shA2AR组细胞中，SCH58261组使用A2AR拮抗剂SCH58261处理细胞，收集处理后的4组U87细胞，应用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测细胞中A2AR mRNA表达水平，蛋白质免疫印记（Western Blot）检测细胞中A2AR 蛋白表达水平，流式细胞术检测细胞周期分布，细胞肿瘤球形成实验检测细胞干性，LC3自噬双标腺病毒实验检测自噬溶酶体与自噬体形成，流式细胞术检测细胞凋亡，Western Blot检测细胞中干细胞标记物巢蛋白（Nestin）、SRY相关高迁移率族盒蛋白2（SOX2）、八聚体结合转录因子4（OCT4）以及自噬相关分子微管相关蛋白3（LC3）II/LC3I、Beclin1的蛋白表达水平。 结果与对照组比较，shA2AR组和SCH58261组U87细胞中A2AR mRNA相对表达量与蛋白相对表達量降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；G1期细胞比例增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；S期细胞比例减少，差异具有统计学意义（P<0.05）；肿瘤球形成数目减少，差异具有统计学意义（P<0.05）；细胞中红色斑点代表的自噬溶酶体与黄色斑点代表的自噬体均明显增多，细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；细胞中Nestin、SOX2、OCT4蛋白相对表达量减少，差异具有统计学意义（P<0.05）；同时，LC3II/LC3I蛋白比值升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；Beclin1蛋白相对表达量也增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论阻滞A2AR能够使人胶质瘤U87细胞发生G1期阻滞，抑制肿瘤细胞干性特征，并促进保护性自噬，诱导细胞发生凋亡。

【关键词】胶质瘤；腺苷A2A受体；干性特征；保护性自噬

【中图分类号】R739.41【文献标志码】A【文章编号】1672-7770（2024）01-0031-07

Blocking adenosine A2A receptors inhibits glioma cell stemness and induces protective autophagy DENG Guoqi， SHENG Qiang， SHAO Yunxiang， et al. Department of Neurosurgery， The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China

Corresponding author： XU Jingxuan

Abstract： ObjectiveTo investigate the effects of blocking adenosine A2A receptor（A2AR） on the stemness characteristics and protective autophagy of glioma cells. MethodsHuman glioma U87 cells were divided into four groups， control group， shNC group， shA2AR group and SCH58261 group， shNC and shA2AR cells were transfected into shNC group and shA2AR group， respectively. SCH58261 group was treated with A2AR antagonist SCH58261. Four groups of U87 cells were collected after treatment， real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to detect A2AR mRNA expression level in cells. Western blot was used to detect A2AR protein expression level in cells. Flow cytometry was used to detect cell cycle distribution. Cell tumor pellet formation assay was used to detect cell dryness. LC3 autophagy double-label adenovirus assay was used to detect the formation of autophagosome and autophagosome. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Western blot was used to detect the expression levels of stem cell marker Nestin（Nestin）， SRY-associated high mobility group box protein 2（SOX2）， octamer binding transcription factor 4（OCT4） and autophagy related molecules microtubule associated protein 3（LC3） II/LC3I and Beclin1. ResultsCompared with the control group， the mRNA relative expression level and protein relative expression level of A2AR in U87 cells of shA2AR group and SCH58261 group were decreased. The difference were statistically significant（P<0.05）. The proportion of cells in G1 phase was increased. The difference was statistically significant（P<0.05）. The proportion of cells in S phase was decreased. The difference was statistically significant（P<0.05）. The number of tumor spheres formed was decreased. The difference was statistically significant（P<0.05）. The number of autophagosomes represented by red spots and autophagosomes represented by yellow spots in cells significantly increased， and the apoptosis rate increased， with a statistically significant difference（P<0.05）. The relative expression levels of Nestin， SOX2， and OCT4 proteins in cells decreased with statistical significance（P<0.05）. Meanwhile， the ratio of LC3II/LC3I protein increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The relative expression level of Beclin1 protein also increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. ConclusionBlocking A2AR can induce G1 phase arrest of human glioma U87 cells， inhibit the stemness characteristics of tumor cells， promote protective autophagy， and induce cell apoptosis.

Key words： glioma; adenosine A2A receptor; stemness characteristics; protective autophagy

基金项目：自治区科技支疆项目计划（指令性）项目（2022E02060）

作者单位：830000 乌鲁木齐，新疆医科大学第二附属医院神经外科

通信作者：徐敬轩

胶质瘤是神经上皮起源的恶性肿瘤，常发生在脑和脊髓中，其特征是高侵袭性、高复发率及高死亡率［1］。胶质瘤占所有原发性脑肿瘤的24.7%，占恶性脑肿瘤的74.6%［2］。胶质瘤患者通常接受常规治疗，包括手术切除联合放疗和化疗。近年来，尽管胶质瘤的诊断和治疗取得了一定进展，但接受治疗的患者预后仍然较差，迫切需要阐明胶质瘤进展的潜在机制，并开发新的治疗策略来靶向肿瘤进展并降低复发率。胶质瘤干细胞被认为是胶质瘤治疗期间频繁复发和持续转移侵袭的关键驱动因素，该干细胞可分化为新的肿瘤细胞，维持肿瘤生长，并且对化疗药物具有抵抗性［3-4］。因此，只有遏制胶质瘤细胞的干性细胞特征才能从根源上控制或治疗胶质瘤。

腺苷A2A受体（adenosine A2A receptor，A2AR）是典型的G蛋白偶联受体，主要与Gs蛋白偶联，由410个氨基酸组成［5］。A2AR对配体腺苷具有高亲和力，在病理条件或外部刺激下，ATP被CD39和CD73依次水解为腺苷，腺苷与A2AR结合后增加了cAMP的浓度，激活一系列下游信号通路，起到免疫抑制和促进肿瘤侵袭的作用［6］。研究表明，阻滞A2AR途径可以抑制多种实体瘤的发生与进展［7-8］。因此，本研究通过shRNA A2AR与腺苷A2A受体阻断剂SCH58261以阻滞人胶质瘤U87细胞中A2AR表达，探究其对U87细胞干性特征与保护性自噬的影响，以期为临床上胶质瘤治疗提供新的策略。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂人胶质瘤U87细胞购于美国模式菌种收集中心，腺苷A2A受体阻断剂SCH58261购于美国Sigma公司，shRNA A2AR与阴性对照shRNA NC交由上海生工生物工程有限公司设计并合成。胎牛血清、青-链霉素及DMEM培养基购于美国Gibco公司，LipofectamineTM RNAi MAX和Trizol试剂盒购于美国invitrogen公司，反转录试剂RT reagent Kit与SYBR Premix Ex Taq试剂盒购于日本Takara公司，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BeyoECL Plus、PI染液及DAPI染液购于上海碧云天生物研究所，pCMV GFP-RFP-LC3慢病毒购于上海汉恒生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，A2AR、Nestin、SOX2、OCT4、LC3II、LC3I、Beclin1及GAPDH多克隆抗体购于英国Abcam 公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG购自美国ProteinTech公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组处理人胶质瘤U87细胞采用含10%胎牛血清与1%青-链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养。取培养至对数生长期的细胞，分为对照组、shNC组、shA2AR組、SCH58261组，各分组处理如下：（1）对照组，U87细胞正常培养；（2）shNC组，将shRNA NC转染至U87细胞；（3）shA2AR组，将shRNA A2AR转染至U87细胞；（4）SCH58261组，使用10 μM SCH58261处理U87细胞48 h。细胞转染使用LipofectamineTM RNAi MAX 转染试剂进行，按照说明书配置反应体系进行转染。转染结束后换液，收集各处理组的U87细胞。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测细胞A2AR mRNA表达水平Trizol法提取U87细胞总RNA，按照试剂盒说明书操作。取获得的总RNA，通过反转录合成cDNA，再以cDNA为底物，qRT-PCR法检测A2AR mRNA表达水平，参照SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行扩增反应，程序设定为：95 ℃预变性15 s，循环1次；95 ℃变性5 s、60 ℃退火20 s，循环45次；72 ℃延伸10 s，循环45次。在扩增结束后制作溶解曲线，采用2-ΔΔCt法分析数据，以GAPDH作为内参基因。引物具体序列：A2AR上游序列5′-AGGCAGCAAGAACCTTTCAA-3′，下游序列5′-CTAAGGAGCTCCACGTCTGG-3′，产物236 bp；GAPDH上游序列5′-GGACTCATG-ACCACAGTCCA-3′，下游序列5′-TCAGCTCAGGGA-TGACCTTG-3′，产物157 bp。

1.2.3蛋白质免疫印记（Western Blot）在U87细胞中添加RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。添加上样缓冲液稀释蛋白，100 ℃金属浴煮沸变性，将等量变性后的蛋白依次上样，通过10%SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜上，浸于5%脱脂奶粉中室温封闭2 h。TBST洗膜，分别以A2AR、Nestin、SOX2、OCT4、LC3II、LC3I、Beclin1多克隆抗体作为一抗，均按1∶1 000稀释后，将膜浸入抗体稀释液中，置于4 ℃过夜。取膜复温，TBST洗膜，将对应二抗按1∶5 000稀释，再将膜浸入二抗稀释液中，室温孵育2 h，TBST再次洗膜，滴加BeyoECL Plus显色，根据蛋白条带显影情况调整曝光时间，Image J软件分析各蛋白条带灰度值，以GAPDH作为内参蛋白，计算各个目的蛋白的相对表达量。

1.2.4流式细胞术检测细胞周期分布采用0.25%胰酶消化U87细胞，以4 000 rpm离心5 min，预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤沉淀后，加入0.3 mL PBS重悬细胞，再加入0.7 mL乙醇，混合均匀后，置于4 ℃固定12 h，以1 000 rpm离心5 min，弃上清，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液缓冲液，37 ℃避光孵育30 min，结束后离心，加入1 mL PBS重悬沉淀，24 h内通过流式细胞仪分析周期分布。

1.2.5细胞肿瘤球形成实验检测细胞干性将U87细胞用成球培养基重悬，调整密度为 1 600个/mL，按每孔800个的密度铺于低黏附的 24 孔板中，轻轻晃动防止贴壁，并置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养。7 d 后取出，通过光学显微镜观察细胞肿瘤球形成情况并计数。

1.2.6LC3自噬双标腺病毒实验将U87细胞按照1×105个/孔的密度接种于6孔板中过夜培养，使用pCMV GFP-RFP-LC3慢病毒转染细胞，感染复数设为50，感染12 h后，再更换为含5 μg/mL嘌呤霉素的正常培养液培养。将感染后的细胞分组处理后，4%多聚甲醛固定，穿膜打孔后，DAPI染核1 min，通过荧光共聚焦显微镜观察细胞染色情况并拍照。

1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡将SU87细胞置于干净流式检测管内，0.25%胰酶消化，以4 000 rpm离心10 min，弃上清，PBS洗涤沉淀，再加入500 μL 流式检测缓冲液重悬细胞，接着避光加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，涡旋混匀，室温孵育20 min，通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.3统计学分析使用GraphPad Prism 7.0分析数据并制作统计图，计量资料以均数±标准差（x±s）来描述。多组间数据比较采用方差分析，LSD-t检验进行两组间数据比较，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1shRNA转染与腺苷A2A受体阻断剂SCH58261处理后U87细胞中A2AR表达变化U87细胞经过shRNA转染与腺苷A2A受体阻断剂SCH58261处理后，与对照组比较，shA2AR组和SCH58261组细胞中A2AR mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均减少，差异有统计学意义（均P<0.05），而对照组与shNC组之间差异无统计学意义（均P>0.05），见图1、表1。

2.2阻滞A2AR对U87细胞周期分布的影响流式细胞术检测周期分布结果显示，与对照组比较，shA2AR组和SCH58261组U87细胞G1期细胞比例增加，差异有统计学意义（均P<0.05），S期细胞比例减少差异有统计学意义（均P<0.05）；shNC组细胞G1期、S期、G2期的细胞比例与对照组之间均无显著差异（均P>0.05），见图2、表2。

2.3阻滞A2AR对U87细胞肿瘤球形成的影响细胞肿瘤球形成实验检测结果显示，与对照组比较，shA2AR组和SCH58261组细胞肿瘤球形成数目减少，差异有统计学意义（均P<0.05）；shNC组与对照组细胞肿瘤球形成数目无显著差异（P>0.05），见图3、表2。

2.4阻滞A2AR对U87细胞自噬水平的影响免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，shA2AR组和SCH58261组U87细胞中红色斑点代表的自噬溶酶体、黄色斑点代表的自噬体均明显增多；而与对照组比较，shNC组细胞中红色斑点代表的自噬溶酶体、黄色斑点代表的自噬体均未发生明显变化，见图4。

2.5阻滞A2AR对U87细胞凋亡的影响流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，与对照组比较，shA2AR组和SCH58261组细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（均P<0.05）；而shNC组与对照组细胞凋亡率之间无显著差异（P>0.05），见图5、表2。

2.6阻滞A2AR对U87细胞干性特征与自噬相关蛋白表达的影响Western Blot测定结果显示，与对照组比较，shA2AR组和SCH58261组Nestin、SOX2、OCT4蛋白相对表达量减少，差异有统计学意义（均P<0.05）；shNC组Nestin、SOX2、OCT4蛋白相对表达量较对照组均无显著差异（P>0.05），见图6、表3。与对照组比较，shA2AR组和SCH58261组LC3II/LC3I蛋白比值升高，差异有统计学意义（均P<0.05），Beclin1蛋白相对表达量增加，差异有统计学意义（均P<0.05）；shNC组LC3II/LC3I蛋白比值、Beclin1蛋白相对表达量较对照组均无显著差异（P>0.05），见图7、表3。

3讨论

A2AR的激活导致免疫抑制和肿瘤转移，并抵抗肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤进程。最新一項研究表明，A2AR的高表达与胶质瘤男性患者的生存率降低有关；此外，A2AR还与主要富集于局灶黏着和细胞外基质相互作用的基因密切相关，并诱导上皮间充质转化、血管生成和胶质瘤生长［9］。由此提示，A2AR可能是胶质瘤有希望的治疗靶点。目前，使用A2AR拮抗剂或A2AR敲除技术阻滞A2AR途径可显著提高抗肿瘤效果，例如，A2AR拮抗剂Ciforadenant（CPI-444）在肾细胞癌患者中可以安全地阻断体内腺苷信号传导，发挥抗肿瘤活性作用［10］。使用负载siRNA A2AR的纳米颗粒治疗结肠癌CT26细胞和乳腺癌4T1细胞构建的移植瘤小鼠，不仅能抑制肿瘤生长，而且增加了抗肿瘤免疫应答反应和小鼠存活时间［11］。本研究采用shRNA A2AR转染与腺苷A2A受体阻断剂SCH58261处理人胶质瘤U87细胞后，检测结果显示，两种作用下细胞中A2AR mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均减少，提示shRNA A2AR转染或使用腺苷A2A受体阻断剂SCH58261均能够阻滞U87细胞中A2AR的表达水平。

肿瘤细胞的异质性长期以来备受重视，肿瘤干细胞是胶质瘤的重要组成部分。肿瘤干细胞可由常见的干细胞标志物标记，如CD133、CD44、Nestin、SOX2、OCT4等，这些标记分子可以与免疫生态位因子及细胞微环境共同作用，调节胶质瘤的肿瘤发生和进展［12］。在胶质母细胞瘤中，Nestin不仅是肿瘤细胞干性特征的标志物，还是评估患者预后的重要指标［13］。SOX2和OCT4是控制肿瘤细胞干性和发育的转录因子，SOX2是SRY相关HMG-box（SOX）转录因子家族的成员，通过与其他干细胞标志物如NANOG和OCT4复合，刺激成体细胞重编程为多能干细胞，并在肿瘤细胞中维持干细胞样特性［14］。OCT4属于POU（Pit-Oct-Unc）转录因子家族，其在肿瘤干细胞样细胞中通过调控其靶基因参与肿瘤细胞自我更新和肿瘤发生［15］。本研究结果显示，经过shRNA A2AR转染与腺苷A2A受体阻断剂SCH58261处理人胶质瘤U87细胞后，肿瘤球形成数目减少，细胞中Nestin、SOX2、OCT4蛋白相对表达量也减少，该结果说明阻滞A2AR能够抑制U87细胞的干性特征。

自噬可以去除受损或衰老的细胞器，在调节肿瘤进展和肿瘤治疗反应中起重要作用。自噬在肿瘤中的作用相对复杂，主要取决于肿瘤类型、分期和遗传背景，其可以通过防止受损蛋白质和细胞器的积累而起到肿瘤抑制作用，也可以通过提供代谢底物促进细胞内循环从而有助于肿瘤生长［16-18］。而响应抗肿瘤治疗而触发的自噬可能与细胞死亡有关，可导致肿瘤细胞中促死亡信号通路的激活［19］。在自噬体形成过程中，胞质LC3I与磷脂酰乙醇胺结合，转化为其酶促LC3II对应物，并聚集在自噬体膜上，因此LC3II/LC3I是衡量自噬水平的重要指标［20］。Beclin1是磷脂酰肌醇3-激酶复合物的组成部分，作为酵母ATG6的哺乳动物直系同源物，在自噬中起核心作用［21］。本研究结果显示，经过shRNA转染与腺苷A2A受体阻断剂SCH58261处理人胶质瘤U87细胞后，自噬溶酶体与自噬体均明显增多，LC3II/LC3I蛋白比值升高，Beclin1蛋白相对表达量增加，同时，细胞凋亡率也增加，由此说明，阻滞A2AR能够诱导U87细胞的保护性自噬，促进细胞凋亡的发生。

综上所述，利用shRNA A2AR转染与腺苷A2A受体阻断剂SCH58261阻滞U87细胞中A2AR表达后，能够使U87细胞发生G1期阻滞，减少肿瘤球形成数目，抑制干性标记物Nestin、SOX2、OCT4蛋白表达，并促进自噬溶酶体与自噬体形成，提高LC3II/LC3I蛋白比值及Beclin1蛋白表达，进而诱导细胞凋亡。本研究为靶向A2AR治疗胶质瘤提供了新的参考依据，但作用机制尚未明确，有待后续深入探究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

［参 考  文  献］

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（收稿2023-06-06修回2023-09-10）