竹沥茶化学成分及其体外生物活性

许继业，彭佳堃，高健健，李亚隆，孙若璠，易景波，匡蓓，戴伟东，谭俊峰，林智

（1.中国农业科学院茶叶研究所/农业农村部茶叶质量安全控制重点实验室,浙江杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院,北京 100081；3.政协宜昌市委员会,湖北宜昌 443000；4.长阳土家族自治县农业产业服务中心,湖北长阳 443500）

竹沥茶是湖北长阳土家族自治县城五河村特有的茶叶类型[1]。竹沥茶的制作大致分为茶叶基底制备、火炙竹沥制备和足火“赋香”3 个环节。其中,茶叶基底的制备与当地绿茶的加工过程相似。火炙竹沥的制备过程大致为取新鲜竹杆,两端去节,用柴火烤出汁液,即火炙竹沥。最后,在足炕叶中添加火炙竹沥,再足火烘干“赋香”得到竹沥茶成品。这一具有再加工茶特点的竹沥茶制法赋予茶叶特有的风味,深受当地百姓喜爱,但在茶叶相关典籍和文献中鲜有记载。

竹沥是指竹的新鲜茎杆经过高温干馏制得的汁液[2],其颜色为黄色至红棕色,具有焦糖香,味微甜[3],可用于治疗痰热咳嗽、中风痰迷、癫痫、小儿咳喘等症状[4-5],具有一定的抗炎[6-7]、抑菌[8]作用。竹沥中的化学成分主要有酚类、醛类、醚类及一些小分子物质[7,9]。肖小武等[10]在8 种不同基原竹种制备的竹沥中共鉴定了26 种挥发性成分,其中酚类成分最多,总相对百分含量均达到70%以上,以苯酚和愈创木酚及其同系物为主。Gao 等[11]对竹沥中26 种主要化合物进行分离和鉴定,其中它乔糖甙、二甲氧基羟基苯基葡萄糖苷和南烛木树脂酚葡萄糖苷3 种物质为竹沥的主要化学成分,推测竹沥中主要化学成分具有潜在的生物活性。这些竹沥中的主要成分与茶叶中报道较多的化学成分如茶多酚、茶多糖等非挥发性成分和醇类、酯类等挥发性成分有较大差异。此外,茶叶中含有多种生物活性成分,具有抗氧化、降血压、降血糖等功能活性[12-16]。因此,在茶叶加工过程中进行竹沥“赋香”,可能会改变茶叶的化学成分及其生物活性。

为探究竹沥茶的化学品质特征,本研究采用搅拌棒吸附萃取-气相色谱-质谱联用（stir bar sorptive extraction-gas chromatography-mass spectrometry,SBSE-GC-MS）法和超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole-exactive/mass spectrometry,UHPLC-Q-Exactive/MS）法对竹沥茶及其加工过程中样品的挥发性成分和非挥发性成分进行检测,并采用α-葡萄糖苷酶抑制率和胆酸盐结合率两种体外活性表征方法分别对竹沥茶提取液的降血糖活性和降血脂能力进行初步筛查,以期加深对竹沥茶的了解,并为地方特色茶叶的发掘和利用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（均为色谱纯）:美国Merck 公司；甲酸（色谱纯）:日本TIC 公司；α-葡萄糖苷酶（129 U/mg）:上海意果科技有限公司；阿卡波糖（纯度97%）:上海迈瑞尔化学技术有限公司；儿茶素标准品、咖啡碱标准品（纯度均≥98%）:武汉天植生物技术有限公司；甜菜碱标准品（纯度99%）:上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱仪（UHPLC-QExactive/MS）:美国Thermo Fisher 公司；气相色谱-质谱联用仪（7890A-5975C）:美国Agilent 公司；超高效液相色谱仪（Acquity H-Class）:美国Waters 公司；酶标仪（CYTATION1）:美国Bio-Tek 公司；粉碎研磨机（A11）:德国IKA 公司；电子天平（SQP）:德国Sartorius 公司；电热恒温水浴锅（DK-S11）:上海森信实验仪器有限公司；高速冷冻离心机（5810R）:德国Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

竹沥茶详细制作工艺参考李亚隆等[1]的方法。取新鲜竹杆（水竹PhyllostɑchysheteroclɑdɑOliver,直径约4 cm）,截成30～50 cm 长,两端去节,用柴火烤出汁液,得到火炙竹沥。茶叶基底主要制作步骤:茶鲜叶（当地群体种,一芽一、二叶为主）→摊放（摊放厚度2 cm,时间8 h,温度不高于30 ℃）→杀青（250 ℃）→揉捻成条→二青（180 ℃）→初炕（110～120 ℃）→复揉（手工揉搓形成松针型或眉芽型）→二炕（90～100 ℃）→三揉（同复揉）→三炕（80～90 ℃,干燥至八成）→足炕（90～100 ℃,至含水率5.5%）→足炕叶。以足炕叶为茶叶基底,添加竹沥[竹沥原汁与茶叶（鲜重）的液料比为1∶100（mL/g）],于竹笼中烘干“赋香”（90～100 ℃）,得到竹沥茶成品（含水率5.5%以下）。

固样:取50 g 茶鲜叶进行微波杀青预处理（微波功率1 000 W,处理时间2 min）。另取茶叶基底制作过程中的杀青叶、揉捻叶、二青叶和足炕叶各约50 g,与经过微波杀青预处理的鲜叶一起,统一用竹笼烘干（90～100 ℃）至含水率5.5%以下,备用。

1.3.2 感官审评

参照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》绿茶审评方法,称取3.0 g 样品,注入150 mL 沸水,加盖计时4 min,滤出茶汤,对茶汤的香气、滋味和色泽进行评价。审评小组成员7 名,男性3 名（年龄分别为57、43、28 岁）,女性4 名（年龄分别为38、28、25、24 岁）,均具有评茶员及以上资格。

1.3.3 基于SBSE-GC-MS 的挥发性化学成分测定

参照Yan 等[12]建立的方法。采用磁力搅拌棒吸附萃取法进行前处理,取1.0 mL 竹沥或1.0 g 竹沥茶粉及竹沥茶加工过程的样品置于顶空玻璃瓶,加入100 ℃的蒸馏水 10 mL,将聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane,PDMS）搅拌子放入顶空瓶,旋紧瓶盖,70 ℃磁旋搅拌30 min,转速1 200 r/min,取出搅拌子,并用纯净水洗净擦干后存放于1.5 mL 进样瓶中,用于气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）分析,重复3 次。

热脱附、冷进样系统方法参考文献[12]:初始温度30 ℃,保持1 min,以100 ℃/min 升温至240 ℃,并保持5 min；氮气（99.99%）在100 ℃下保持1 min 后,以12 ℃/s 的速度升温至280 ℃,保持3 min。

气相（gas chromatography,GC）条件参考文献[17]:HP-5MS 色谱柱（30 m×250µm×0.25µm）,升温程序:50 ℃保持2 min,以4 ℃/min 的速率升温至170 ℃,保持5 min,再以10 ℃/min 的速率升温至265 ℃,保持5 min；载气为氦气（>99.99%）,流速为1.6 mL/min。质谱（mass spectrometry,MS）条件:电子电离源（electron ionization,EI）,电子能量70 eV；接口温度280 ℃；离子源温度220 ℃；扫描范围30～600 amu。

1.3.4 基于UHPLC-Q-Exactive/MS 的非挥发性成分测定

竹沥前处理方法:竹沥与纯甲醇按体积比1∶9 混合,8 000 r/min 离心5 min,上清液过0.22µm 尼龙滤膜,用于液相色谱质谱联用（liquid chromatographymass spectrometry,LC-MS）分析,重复3 次。

茶样前处理方法参考文献[18]:称取0.1 g 竹沥茶粉及竹沥茶加工过程样品置于50 mL 离心管中,加入提取溶剂20 mL（甲醇∶水=70∶30,体积比）,70 ℃水浴30 min,8 000 r/min 离心5 min,上清液过0.22µm 尼龙滤膜,用于LC-MS 分析,重复3 次。

UHPLC-Q-Exactive/MS 分析条件:T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7µm）；柱温40 ℃,流速0.4 mL/min,进样量3µL；二元梯度洗脱,流动相A 为0.1%的甲酸水溶液,流动相B 为0.1% 甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度:0 min,2%B 相；0.5 min,2%B 相；10 min,15%B 相；18 min,40%B 相；20 min,90%B 相；20.9 min,90%B 相；21 min,2% B 相；25 min,2% B 相。四极杆轨道阱MS参数设置:电喷雾离子源（electrospray ionization,ESI）；检测模式为ESI 正离子模式；毛细管电压3.5 kV,温度300 ℃；辅助气温度350 ℃,流速10 L/min；质谱扫描范围为质荷比（m/z）100～1 000。

1.3.5 基于超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography,UHPLC）的儿茶素和咖啡碱定量测定

采用1.3.4 中过0.22µm 尼龙滤膜的上清液,稀释一倍后用于UHPLC 测定。

UHPLC 分析条件:色谱柱Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7µm）；流动相:A 相为0.1% 的甲酸水溶液（1∶1 000,体积比）,B 相为甲醇；进样量:5µL；流速:0.35 mL/min；柱温:35 ℃。流动相洗脱梯度:0 min,3%B 相；3 min,8%B 相；7.5 min,20%B 相；11 min,20% B 相；13 min,60% B 相；14.5 min,60% B相；15 min,3%B 相；19 min,3%B 相。

1.3.6 体外活性测定

1）样品提取:称取0.3 g 竹沥茶粉末置于50 mL 离心管中,加入沸水15 mL,沸水浴中振荡浸提10 min,8 000 r/min 离心5 min,取上清液过0.45µm 水膜,过膜后将上清液用于α-葡萄糖苷酶抑制活性和胆酸盐结合率测定。用于活性测定的竹沥茶剂量均以竹沥茶干茶计算。

2）α-葡萄糖苷酶抑制活性测定:将50µL 待测液和100µL α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL,溶于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液,pH6.8）,25 ℃孵育10 min 后,加入50µL 5 mmol/L 对硝基苯-β-D-葡萄糖苷溶液（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG）,pNPG 溶于pH6.8的0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液作为底物,再孵育5 min。以1 mg/mL 的阿卡波糖作为阳性对照,记录酶标仪在405 nm 处的吸光度。

3）胆酸盐结合率测定:取1 mL 样品于具塞试管中,加入1.5 mL 胃蛋白酶（pH6.3 的0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制）和0.01 mol/L 盐酸溶液,在37 ℃恒温振荡消化1 h。用0.1 mol/L 氢氧化钠调节pH 值为6.3,加入2 mL 胰蛋白酶溶液（10 mg/mL,pH6.3 的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制）,37 ℃恒温振荡消化1 h。加入2 mL胆酸盐溶液（0.3 mg/mL,pH6.3 的0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制）,37 ℃恒温振荡1 h,4 000 r/min 离心20 min。精密量取0.5 mL 上清液,加入质量分数为60% 的硫酸溶液1.5 mL,混匀,70 ℃水浴加热20 min,冰浴5 min 后,采用紫外可见分光光度法于387 nm 波长处测定吸光度,以水作为空白对照。

1.4 数据处理

通过GC-MS 得到的原始图谱采用Agilent chemstation/LECO ChromaTOF 工作站（NIST2014 谱库）和NIST Chemistry Webbook,结合正构烷烃保留指数、化合物理论和实际保留指数以及特征离子等进行化合物准确定性,并利用峰面积归一化后数据进行定量分析。采用UHPLC-Q-Exactive/MS 检测得到的原始图谱采用Compound Discoverer 3.2 软件进行峰面积提取与峰匹配。通过精确分子量、二级质谱、代谢组学数据库（HMDB、GNPS 等）和标准样品进行结构鉴定。采用SIMCA-P 14.1 绘制主成分分析（principal component analysis,PCA）图；采用SPSS 25 进行方差分析；采用Origin 8.0 绘制韦恩图。

2 结果与分析

2.1 感官审评结果

竹沥、竹沥茶和不含竹沥的足炕叶（茶叶基底）的感官审评结果如表1 所示。

表1 竹沥、足炕叶和竹沥茶风味特征描述Table 1 Flavor characteristics of bamboo juice，zukangye and bamboo juice tea

由表1 可知,竹沥是一种微黄透明且有焦香、味微甜略带酸涩的汁液。竹沥茶和足炕叶均有嫩香,但竹沥茶还微带焦糖香和坚果香,香气特征较足炕叶发生了一定变化。竹沥茶和足炕叶均表现为滋味尚醇,微带涩,但竹沥茶还微有回甘。汤色方面,竹沥茶汤色绿黄、明亮,足炕叶汤色黄绿、明亮,竹沥茶汤色较足炕叶微黄。审评结果表明,添加竹沥后,茶叶的香气、滋味和汤色发生了感官可察觉的变化,推测可能与竹沥添加前后茶叶化学成分的变化有关。

2.2 挥发性成分分析

挥发性成分分析结果见图1。

图1 挥发性成分分析Fig.1 Analysis of volatile components

由图1A 可知,从竹沥茶中定性检测鉴定出157 个挥发性风味成分,其中包括27 个烯类、19 个酯类、18 个烷烃类、12 个烯醇类、11 个烯酮类、10 个醛类、10 个芳香烃类、7 个烯酯类、6 个醇类、6 个氧杂环化合物、6 个酚类、6 个酮类、5 个有机酸类、5 个氮杂环化合物等。由图1B 可知,竹沥和足炕叶中分别定性检测到75 个和141 个挥发性风味成分,其中两种是竹沥和竹沥茶共有且足炕叶中不含有的成分。

当前关于竹沥挥发性成分分析的研究中检测到的挥发性成分种类较少,如肖小武等[10]在竹沥中共鉴定了26 种挥发性成分,且以酚类化合物为主[11]。本研究采用SBSE-GC-MS 方法对竹沥、竹沥茶和足炕叶进行检测,结果见表2。

表2 竹沥、竹沥茶和足炕叶中的主要挥发性成分相对峰面积Table 2 Relative peak area of main volatile components detected from bamboo juice，bamboo juice tea and zukangye

竹沥中共定性检测到75 个挥发性成分,其中酚类成分相对峰面积约占总相对峰面积的一半以上,醛类（如糠醛）、酮类、醇类等成分也是竹沥中的主要挥发性成分。由表2 可知,竹沥、竹沥茶和足炕叶中相对峰面积在0.5%以上的成分分别有18、25 个和24 个。4-乙基-2-甲氧基苯酚、甲氧甲酚和二氢丁香酚等酚类物质在竹沥中相对峰面积较高,但在竹沥茶中未能检测到,这可能是因为“赋香”过程中竹沥中的部分成分发生降解或挥发等理化变化,故在竹沥茶中无法检测到。

结合竹沥、足炕叶以及竹沥茶挥发性成分峰面积归一化结果,通过设定比值竹沥茶/足炕叶>1 且比值竹沥/足炕叶>1限定条件筛查,确定糠醛、2-甲基吡嗪为茶叶基底本身不含有,而是在添加竹沥后新增加的香气化合物,其在竹沥茶制作过程中的变化规律如图2 所示。

图2 竹沥茶加工过程中糠醛和2-甲基吡嗪的峰面积变化Fig.2 Peak area changes of furfural and 2-methylpyrazine during the process of bamboo juice tea

由图2 可知,糠醛、2-甲基吡嗪可作为判定竹沥茶与普通茶叶差异的特征香气成分。香气是衡量茶叶品质的重要评价指标[19]。有报道表明糠醛具有甜味、木香、面包香、坚果香、焦糖香[20-21]；加工过程中还原性糖与氨基酸、蛋白质等在高温条件下发生美拉德反应生成吡嗪、吡咯等含氮化合物,呈现焦糖香和甜香,如2-甲基吡嗪呈坚果香、霉香、烤香、壤香[22]。糠醛和2-甲基吡嗪是在茶叶基底中添加竹沥“赋香”后新增加的成分,形成了竹沥茶区别于足炕叶的特有焦糖香和坚果香的香气特征。足炕叶和竹沥茶均具有嫩香的香气特征,表明茶叶原料嫩度好、持嫩性强,故竹沥茶和足炕叶均具有嫩香。此外,香叶醇、芳樟醇、反式-β-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮等化合物气味阈值较低,是多种茶叶中的主要香气贡献成分,也是形成茶叶花果香和甜香特征的物质基础[17]。由表2 可知,竹沥茶中芳樟醇、反式-β-紫罗兰酮相对含量显著高于足炕叶（P<0.05）,提示竹沥茶较足炕叶具有甜香、花果香的香气特征。

2.3 非挥发性成分分析

采用UHPLC-Q-Exactive/MS 对非挥发性成分进行检测分析,结果见图3。

图3 非挥发性成分分析Fig.3 Analysis of non-volatile components

从竹沥茶、足炕叶和竹沥样品中分别结构鉴定出非挥发性成分157、156 个和79 个。由图3A 可知,竹沥茶非挥发性化合物主要类别包括儿茶素类10 个、二聚儿茶素类14 个、黄酮糖苷类24 个、N-乙基-2-吡咯烷酮取代的儿茶素类（N-ethyl-2-pyrrolidone-substituted flavanol,EPSF）7 个、酚酸类8 个、生物碱类15 个、氨基酸类15 个、有机酸类15 个以及其它49 个。而竹沥中的非挥发性成分主要为生物碱类、氨基酸类、核苷/碱基类、脂类、有机酸类、糖类及其衍生物等,与茶叶基底含有的化合物类型相差较大,其中甜菜碱、棕榈酸、异柠檬酸、柠檬酸、植物鞘氨醇、蔗糖、胆碱、D-1,5-脱水果糖、脯氨酸、乙基香兰素葡萄糖苷等相对峰面积较大（相对峰面积在1.0%以上）。由图3B 可知,足炕叶与竹沥茶在第一个主成分上（R2X[1]=0.396）即有明显的分离趋势,说明足炕叶和竹沥茶的非挥发性化合物存在较多差异化合物。通过比值竹沥茶/足炕叶>1 且比值竹沥/足炕叶>1 限定条件筛查,判定乙基香兰素葡萄糖苷为竹沥茶中新增加的化合物,甜菜碱（比值竹沥茶/足炕叶=1.69,比值竹沥/足炕叶=42.81）为茶叶中原本含有但在添加竹沥后相对含量显著增加的化合物。由图3C、图3D可知,竹沥中乙基香兰素葡萄糖苷的相对峰面积为1.01%,是竹沥中主要的非挥发性成分,其在足炕叶中未检测到,但在竹沥茶中其相对峰面积为0.01%,是茶叶中添加竹沥后新增的化合物,其为一种糖苷类潜香物质,可能在茶叶加工或存储过程中分解释放出具有甜巧克力香及香兰素特有芳香香气的乙基香兰素,从而提高竹沥茶的香气品质[23]。竹沥中甜菜碱相对峰面积为53.41%,位居第一,足炕叶中甜菜碱相对峰面积为0.47%,竹沥茶中为0.77%,茶叶添加竹沥后甜菜碱相对峰面积明显升高。甜菜碱具有甜味[24],推测甜菜碱参与了竹沥茶滋味中甜味和回甘的形成。因此,乙基香兰素葡萄糖苷和甜菜碱可作为判定竹沥茶与普通茶叶的特征水溶性成分。

茶叶中主要的水溶性成分是茶汤滋味形成的物质基础。除上述竹沥茶中的特征水溶性成分外,一般认为儿茶素、咖啡碱等与茶叶涩味、苦味的形成有关[25]。竹沥茶和足炕叶中儿茶素组分、咖啡碱等的定量结果见表3。

表3 足炕叶和竹沥茶中儿茶素、咖啡碱以及没食子酸含量Table 3 Quantitative results of catechins，caffeine and GA in bamboo juice tea and zukangye mg/g

由表3 可知,竹沥茶中没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、没食子儿茶素（GC）和没食子酸（GA）含量显著高于足炕叶,而表儿茶素（EC）、儿茶素（C）含量显著低于足炕叶（P<0.05）,这表明在竹沥茶制作过程中,部分儿茶素发生了异构化和没食子酸基团的水解。有报道表明,表型儿茶素（EGCG、EGC）向非表型儿茶素（GCG、GC）转变,会减轻茶叶的苦涩味[26],没食子酸则可与茶叶中其他物质相互协调作用,中和茶汤苦涩味[27],竹沥茶中GCG、GC 和GA 含量较足炕叶显著升高,表明竹沥茶滋味苦涩味更低。

2.4 竹沥茶提取液α-葡萄糖苷酶抑制率和胆酸盐结合率

为探究竹沥茶的体外生物活性,将竹沥茶提取液（20 mg/mL）稀释后进行α-葡萄糖苷酶抑制率和胆酸盐结合率测定,选择测定结果在50%左右的竹沥茶提取液浓度与阳性对照进行比较。结果见图4。

图4 竹沥茶α-葡萄糖苷酶抑制率和胆酸盐结合率Fig.4 The α-glucosidase inhibition rate and cholate binding rate of bamboo juice tea

α-葡萄糖苷酶是体内糖类代谢的关键酶,阿卡波糖通过抑制该酶的活性,可干扰肠道中葡萄糖的吸收,抑制餐后血糖的升高,起到稳定血糖的作用[15]。由图4可知,浓度为0.3 mg/mL 的竹沥茶提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率达到53.78%,显著高于1.0 mg/mL阿卡波糖溶液（P<0.05）,表明竹沥茶α-葡萄糖苷酶抑制活性较强。推测竹沥茶在降低餐后血糖方面可能具有较好的潜在效果。胆酸盐是胆固醇代谢的次级产物,与血脂调节有关,茶叶中活性成分在肠道中可与胆酸盐结合,促使胆固醇向胆酸盐转化,从而达到降低胆固醇的目的[16]。浓度为0.5 mg/mL 的竹沥茶提取液对胆酸盐的结合率达到38.79%,显著高于1.0 mg/mL 考来烯胺（P<0.05）,表明竹沥茶体外胆酸盐结合活性强。推测竹沥茶在调节高血脂方面可能具有较好的功效。

3 结论

采用SBSE-GC-MS、UHPLC-Q-Exactive/MS 等方法对竹沥茶化学品质相关的挥发性成分和非挥发性成分进行了研究,共鉴定出157 种挥发性成分和157 种非挥发性成分,从中筛选出竹沥茶特征挥发性成分2 种（糠醛、2-甲基吡嗪）、特征非挥发性成分2 种（乙基香兰素葡萄糖苷、甜菜碱）,是竹沥茶区别于普通茶叶的特征性化学成分。体外生物活性测定结果表明,竹沥茶的α-葡萄糖苷酶抑制活性和胆酸盐结合能力突出,竹沥茶具有潜在的降血糖和降血脂活性,为后期进一步开展基于动物的体内活性研究奠定了基础。