细胞间黏附分子-1基因多态性与缺血性心肌病易感性及预后的关联

穆巴拉克·亚库甫 热甫开提·阿不都哈力克 孙 娟 艾力曼·马合木提

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)的晚期阶段,近年来其遗传因素在发病机制中备受关注。细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)可能因介导内皮细胞与白细胞、血小板间的起始黏附,在动脉粥样硬化的发展过程中起着重要的作用,并与CHD和ICM的发生、发展密切相关[1]。ICAM-1主要通过特异性结合表达于血管内皮细胞上的相关联受体,促使炎性细胞与内皮细胞的黏附作用,从而诱导并增强炎性反应,促进心室重塑,加重心肌缺血,破坏心功能,在ICM发生及发展中扮演了重要角色。近年来,ICAM-1单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与心血管疾病的关系主要集中在rs5498外显子上,但ICAM-1基因的其他遗传变异与ICM之间的相关性研究匮乏[2～4]。为深入探究ICAM-1基因多态性与ICM易感性及预后的关系,本研究从ICAM-1基因中初步筛选出rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491、rs923366共6个SNP,结合临床资料进行了预实验,为后续进行更多基因位点及更大样本的研究提供实验数据。

对象与方法

1.研究对象:采用病例-对照方法,选取64例在2017年1月～2019年1月就诊于新疆医科大学第一附属医院心力衰竭科且明确诊断为ICM的患者为ICM组,均符合ICM诊断标准[5,6]。排除标准:①除外CHD的特殊并发症;②除外因其他因素导致的心脏扩大与心功能不全;③除外合并严重感染、其他严重心脏、肺、肝脏、肾脏等疾病以及恶性肿瘤。另外随机抽取同期于新疆医科大学第一附属医院健康体检中心进行体检的人群138例作为对照组,除外CHD、严重感染、严重心脏、肺、肝脏、肾脏等疾病及恶性肿瘤。本实验在所有研究对象知情同意的条件下开展,且通过了笔者医院医学伦理学委员会审批(伦理学审批号:K202109-22)。

2.资料的收集及相关定义标准:记录所有研究对象的一般资料包括年龄、性别、民族、体重指数(BMI);血清学指标包括总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、N-末端前体脑利纳肽(NT-proBNP);影像学指标包括左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF);个人史包括吸烟史;既往史包括是否合并2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)、是否合并髙血压。吸烟史定义为连续或累积吸烟≥6个月者且平均>1支/天。高血压及T2DM诊断标准参考相关文献[7,8]。

3.ICAM-1基因目标位点基因型检测:采取外周静脉血10ml,利用全血基因组提取试剂盒(厦门凯硕生物科技有限公司)提取基因组DNA。从NCBI HapMap数据库中查找ICAM-1基因的SNP数据信息,用haploview软件随机标签了6个SNP,分别为rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491及rs923366。应用在线Primer3 软件设计引物,运用多重聚合酶链反应技术对6个目标多态位点所处区段进行扩增。外切核酸酶及虾碱酶纯化扩增产物,再运用SNaPshot多重SNP分型试剂盒(美国Applied Biosystems公司)进行延伸反应。纯化后的延伸产物使用ABI3730XL测序仪(美国Applied Biosystems公司)进行测序,最后用GeneMapper4.1软件对收集的原始数据进行分析后确定6个目标位点基因型。

4.随访:在患者明确诊断为ICM后的3、6、12、24、36个月分别进行电话随访,随访内容包括终点事件发生及其时间,随访的终点事件为心源性死亡。如果未发生终点事件,随访至3年并终止随访。

结 果

1.研究对象的一般情况:ICM组和对照组TC、TG、HDL-C、NT-proBNP、LVEF、吸烟、2型糖尿病比较,差异均有统计学意义(P均<0.05);年龄、性别、BMI、LDL-C、高血压比较,差异均无统计学意义(P均>0.05),详见表1。

表1 ICM组和对照组的一般资料比较

2.ICAM-1基因型、等位基因分布及相对危险度:ICAM-1基因6个SNP位点rs12462944、rs281430、rs281434、rs3093030、rs5491及rs923366基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡,提示人群选择无偏倚。rs12462944、rs281430、rs3093030、rs923366位点基因型和等位基因分布在ICM组与对照组中比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。ICM组rs5491位点AT基因型及等位基因T频数均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),变异型杂合子AT携带者较野生型AA携带者ICM的风险是3.219倍(95%CI:1.524～6.800)。两组rs281434位点AA、AG、GG基因型和A、G等位基因分布比较,差异均无统计学意义(P均>0.05),但在显性遗传模型中,ICM组变异基因型(AG+GG)频率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。变异型AG和GG携带者较野生型AA携带者ICM的风险是2.685倍(95%CI:1.057～6.825),详见表2。

表2 两组人群SNP基因型分布及风险评估[n(%)]

3.多因素Logistic回归分析:以ICM发生与否作为因变量,以年龄、性别、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、吸烟、T2DM、高血压及ICAM-1 6个位点基因型为自变量进行多因素Logistic回归分析。因自变量较多,多因素Logistic回归分析逐步向前回归,结果显示,2型糖尿病、rs5941位点AT基因型是发生ICM的独立危险因素(OR=5.433、3.428,P<0.05),HDL-C高水平是ICM的保护因素(OR=0.192,P<0.05),其中AT型携带者ICM风险是AA型的3.428倍(95%CI:1.517～7.747),详见表3。

表3 影响 ICM的多因素 Logistic回归分析

4.ICM患者心源性死亡多因素COX回归分析:将ICM组年龄、性别、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、NT-proBNP、LVEF、吸烟、T2DM、高血压及ICAM-1 6个位点基因型作为协变量,以心源性死亡作为因变量,进行COX比例风险回归模型分析,结果显示,NT-proBNP水平增高、LVEF水平下降、rs5491位点AT基因型是心源性死亡的危险因素(HR分别为1.861、0.917、5.075,P<0.05),详见表4。

表4 ICM组心源性死亡多因素COX回归分析

5.rs5491位点AA、AT基因型预后差异:绘制Kaplan-Meier生存曲线,并采用Log-Rank检验用于比较两组终点事件发生率的差异。从患者确诊为ICM后开始随访,3年内rs5491位点AT基因型ICM患者较AA基因型心源性死亡风险更高(P<0.05),详见图1。

图1 rs5491位点AA和AT基因型的ICM患者的生存曲线

讨 论

ICAM-1是目前为止研究最多的与动脉粥样硬化相关的黏附分子,近年来关于其多态性与冠状动脉疾病易感性的关联研究多集中在rs5498位点[2,9,10],ICAM-1基因的其他遗传变异与ICM之间的相关性研究甚少,且因遗传背景和种族差异,研究结果并不一致。为明确ICAM-1基因其他位点多态性与ICM的关系,本研究对随机标签出的分别位于外显子区、内含子区及3′非编码区的6个SNP位点进行了研究,结果显示rs5491基因型的变异提高了ICM的患病风险。rs5491位于第2外显子区,近年来有研究证明,外显子错义突变可导致心脑血管疾病的发生[11,12]。Craig等[13]研究发现,rs5491基因变异可导致ICAM-1N-末端区域的结构变化,从而改变其蛋白与淋巴细胞功能相关抗原-1及纤维蛋白原的结合能力,目前也有报道证实了该位点基因突变与其他疾病的相关性[14]。由此推测rs5491与外显子区其他SNP有相似功能特点,可能通过改变ICAM-1的结构甚至结合能力,从而对促进ICM的发生产生一定作用,最终增加ICM的发病风险。

ICAM-1基因多态性还可能通过触发动脉粥样斑块不稳定性,影响冠状动脉疾病患者预后。有研究显示ICAM-1基因rs5498多态性与急性冠脉综合征复发和心血管病死率相关联[15]。本研究也发现携带rs5491AT基因型的ICM患者较携带AA基因型的患者3年内心源性死亡风险高。然而ICAM-1基因多态性与冠状动脉疾病预后的关联性文献仍然有限,需要更多的证据来明确其机制。

rs281434与冠状动脉疾病的相关性尚未得到证实。本研究结果显示,ICAM-1rs281434的多态可能与ICM易感性有关联,但会受其他影响因素的干扰。通常情况下,内含子并不像其他遗传结构那样重要,然而近年来研究表明,内含子在基因转录、基因加工和RNA稳定性中起着至关重要的作用[2]。因此内含子区rs281434多态性可能影响mRNA的加工和稳定性,引起剪接位点的中断从而导致异常剪接的发生,在ICM的发生中起到一定作用。然而本研究中位于内含子区的其他两个SNP的基因型分布在两组的差异无统计学意义,可能是本实验纳入的样本量较小,因而无法准确反映其多态性对疾病易感性的作用,也有可能该位点在蛋白的功能改变上不起主要作用。3′非编码区可以在不同水平上调节基因的表达并介导mRNA的稳定性、降解和亚细胞定位,该区基因表达特征可代表疾病发生的基因组机制,有助于发现新的诊断和治疗方法[16,17]。但本研究中未发现位于3′非编码区的rs3093032和rs923366的多态性与ICM发生相关。

本预实验结果还显示,T2DM是发生ICM的独立危险因素,HDL-C是其保护因素,NT-proBNP高、LVEF低是ICM患者发生心源性死亡的危险因素,与既往研究结果一致[18～21]。

综上所述,本研究发现,ICAM-1基因rs5491多态性与ICM易感性和预后相关,rs5491基因型的变异提高ICM的患病风险,AT型ICM患者较AA型预后较差。rs281434多态性可能与ICM易感性相关。然而本研究没有发现其他ICAM-1基因位点与ICM相关,原因可能为预实验纳入的样本量小,故有必要后续筛选更多的基因位点、扩大样本量以及延长随访时间对本次研究结果给予验证及补充,并进一步揭示ICAM-1基因多态性增加ICM发病及死亡风险的作用机制,为ICM的预防和治疗提供新依据。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。