肝癌患者血清IGFBP1的表达及其临床意义

高瑞环 杨 桂 黎安玲 刘松梅

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌病例的75%～85%,是全球第6位最常见的恶性肿瘤和第四大主要死因[1]。由于肝癌早期表现为无症状进展,大多数患者在首次就诊时就已经进展为肝硬化甚至肝癌[2]。现已明确肝细胞癌的危险因素主要包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染、丙型肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝、代谢综合征、烟草、酗酒、环境毒素等[3]。

IGFBP1(insulin growth factor binding protein 1, IGFBP1)是胰岛素样生长因子结合蛋白超家族的成员,作为主要由肝脏产生的一种分泌性蛋白,广泛存在于体液和组织细胞中,可以调控胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)的半衰期和生物利用度,IGFBP1与IGF的高亲和力可通过抑制IGF与其受体结合,进而抑制胰岛素受体信号转导[4,5]。肿瘤细胞常表现为信号转导和代谢失调,导致糖摄取增多、线粒体功能紊乱以及抗增殖信号逃逸[6]。研究发现,IGFBP1在肿瘤中的作用具有双面性,既发挥抑癌作用,又被认为是癌基因[7]。作为一种肝脏分泌的血清蛋白,IGFBP1被证实在多种实体瘤中有着一定的临床价值,例如食管癌、前列腺癌、胃癌等[8～10]。

近年来有研究指出,慢性丙型肝炎患者血清IGFBP1升高,并且在纤维化阶段明显增加[11]。血清IGFBP1可作为非酒精性脂肪肝患者晚期纤维化的生物学标志物,然而肝癌患者血清IGFBP1的临床意义尚不明确[12]。此外,慢性乙型肝炎是肝癌最常见的危险因素,虽有研究指出HBV感染抑制HepG2细胞分泌IGFBP1,但尚未见HBV感染与血清IGFBP1关系的研究报道[13]。本研究通过检测体检正常对照、慢性乙型肝炎患者、肝癌患者血清IGFBP1的水平,探究肝癌血清IGFBP1变化特征、诊断价值、风险预测等临床意义以及血清IGFBP1与HBV感染的关系。

资料与方法

1.研究对象:本研究为回顾性研究,采用-80℃冻存的血清标本128份,来源于在武汉大学中南医院就诊的体检正常对照个体(CTL组,n=32)、慢性乙型肝炎患者(CHB组,n=32)和肝癌患者(HCC组,n=64),并收集相对应的临床信息和实验室检查结果。纳入标准:①CHB组临床诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》,HCC组临床诊断标准符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》,CTL组无乙型肝炎感染史且实验室检测查结果正常[14,15];②有完善的临床信息和实验室检查结果,至少包括血常规、血清肝肾功能和肿瘤标志物, HBV-DNA或乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)。排除标准:罹患或合并其他恶性肿瘤。本研究方案经由中南医院医学伦理学委员会审批 (伦理学审批号:2017058),患者均签署知情同意书。

2.仪器试剂: 采用贝克曼AU5800全自动生化分析仪检测肝功能,贝克曼DX1800全自动化学发光仪测定甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)。血清IGFBP1的检测采用ELISA试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司),并在PE Enspire多功能酶标分析仪上测定结果, ABI7300型荧光定量PCR分析仪检测血清HBV-DNA。

3.检测方法:按照试剂盒的说明书要求,经预实验确定,使用样品稀释液将血清稀释40倍后,每孔加入100μl稀释样品,同时设立标准品孔和空白对照孔。利用酶标仪在450nm读取吸光度A值。所有的标准品和待测样品的A值减去空白对照孔的A值后,以吸光值作为纵坐标,以浓度作为横坐标,制订标准曲线。待测样品IGFBP1浓度由标准曲线计算得到。

结 果

1.一般资料和临床资料:共纳入32例正常对照(平均年龄为56.28±12.97岁,男性占81.25%),32例CHB患者(平均年龄为53.06±10.23岁,男性占81.25%),64例HCC患者平均年龄为55.95±11.07岁,其中男性占89.06%。如表1所示,3组间年龄和性别比较,差异均无统计学意义,肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、AST/ALT、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、总蛋白、白蛋白(albumin,A)、球蛋白(globulin,G)、A/G、γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶比较,差异均无统计学意义。

表1 纳入研究对象的一般资料和临床资料

2.组间血清IGFBP1水平的比较:3组间(CTL组、CHB组和HCC组)的血清IGFBP1水平存在差异(H=29.427,P<0.001,图1A),其中HCC组的IGFBP1水平明显高于CTL组和CHB组(P<0.05)。然而,CTL组和CHB组的IGFBP1水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。根据HBV-DNA和HBsAg将HCC患者分为HBV阳性患者(HBV-HCC)和HBV阴性患者(HBV+HCC)两组,HBV-DNA≥20 IU/ml或HBsAg≥0.05IU/ml被认为是HBV阳性,否则为HBV阴性,两组HCC患者的血清IGFBP1水平比较,差异无统计学意义(P>0.05图1B),提示HBV感染可能不影响肝癌患者血清IGFBP1的水平。

图1 组间血清IGFBP1水平的比较

3.血清IGFBP1与AFP的相关性:经典指标AFP由于其较好的肝癌诊断效能,常被用于评价肝癌。经检验,3组间(CTL组、CHB组和HCC组)的血清AFP水平比较,差异有统计学意义(H=61.758,P<0.001,图2A),其中HCC组的AFP水平明显高于CTL组和CHB组(P<0.001)。然而,CTL组和CHB组的AFP水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Spearman分析显示,血清IGFBP1与AFP呈正相关(r=0.484,P<0.001,图2B)。这些结果说明血清IGFBP1与血清AFP有较好的一致性,可能与肝癌有关。

图2 血清IGFBP1与AFP的相关性

图3 血清IGFBP1的ROC曲线

4.血清IGFBP1与肝功能指标的相关性:为了进一步探究血清IGFBP1是否与肝功能有关,使用Spearman分析IGFBP1与肝功能指标的相关性。如表2所示,血清与肝功能指标ALT、AST、AST/ALT、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶呈正相关,与总蛋白、白蛋白、A/G呈负相关,提示高水平的血清IGFBP1的水平与较差的肝功能相关。

表2 血清IGFBP1与肝功能指标的相关性

5.血清IGFBP1的诊断效能:为了进一步探究IGFBP1是否对肝癌具有诊断价值,进行ROC曲线的分析与绘制,由于CTL组和CHB组的血清IGFBP1水平并无差异,因此将其合并为非HCC组,结果显示, ROC曲线的曲线下面积为0.773,差异有统计学意义(AUC=0.773, 95%CI: 0.693～0.852,P<0.001)。血清IGFBP1的诊断正确率为77.3%,最佳诊断界值为39.71,此时的敏感度为56.3%,特异性为85.9%。说明血清IGFBP1具有较好的诊断价值。

6.血清IGFBP1对肝癌的风险评估:为了探究血清IGFBP1是否是肝癌发生的风险因子,将CTL组和CHB组合并为非HCC组,使用二元Logistic回归分析后,发现在排除了年龄、性别和AFP影响后,血清IGFBP1仍是肝癌的风险因子(OR=1.049,95%CI:1.014～1.084,P=0.005),详见表3。

表3 血清IGFBP1影响肝癌的二元Logistic回归分析

讨 论

肝癌糖过度消耗、代谢异常以及恶性改变的状态,部分原因可能是IGF-1、胰岛素和葡萄糖的减少,以及IGFBP1表达上升和酮体增加[6]。IGFBP1主要来源于肝脏,因此其与肝脏疾病也密切相关,研究证实,肝癌组织IGFBP1低于正常人和肝硬化患者,IGFBP1可以作为肝癌选择性治疗的反应标志物[16～18]。HMGA2可驱动IGFBP1/Akt途径从而抑制肝癌细胞的恶性表现[19]。这些研究提示IGFBP1在肝癌中发挥作用。本研究发现,肝癌患者血清IGFBP1的水平较高,并且与较差的肝功能相关,同时血清IGFBP1对肝癌有较好的诊断效能。此外,血清IGFBP1还是肝癌的风险因子,提示血清IGFBP1或许可以作为肝癌患者的血清生物学标志物。值得注意的是,IGFBP1的变化趋势在肝癌患者血清与肝癌组织中是不一致的,这种现象还出现于肝癌和胰腺癌组织和血清中klotho蛋白的表达,这或许与IGFBP1的分泌过程和肿瘤微环境有关,其中的原因还需要进一步研究[20,21]。

AFP是早期肝癌诊断的主要血清标志物,AFP的诊断敏感度、特异性分别为61.54%和81.73%,此时的诊断正确率为75.00%[22],然而AFP在多种实体肿瘤中均有高表达,敏感度和特异性受到临床需求的挑战[23]。目前临床上已经将血清甲胎蛋白异质体、异常凝血酶原、和血浆游离微小核糖核酸等指标作为肝癌早期诊断的补充指标[15]。本研究发现,血清IGFBP1对肝癌有较好的诊断效能,特异性达到85.9%,而诊断正确率为77.3%,或许可以作为原发性肝癌的补充诊断指标。

众所周知,HBV感染是肝细胞癌变的重要危险因素,有研究指出,HBV感染患者AFP水平与HBV DNA浓度之间呈正相关,乙肝相关性肝癌患者的血清AFP和PIVKA-Ⅱ升高,并且具有诊断价值,表明AFP和PIVKA-Ⅱ与HBV感染所致肝癌有关[24,25]。而本研究发现,慢性乙肝感染者血清IGFBP1未改变,而且HBV相关肝癌患者的血清IGFBP1的水平与单纯肝癌相当,因此HBV感染似乎不影响血清IGFBP1的水平,但仍需更大的样本量进行验证。本研究结果有待于扩大样本量做进一步临床数据分析或进行深入性实验研究探究机制。此外,由于本研究主要是为了探究IGFBP1在肝癌中的临床意义,所以并没有设置肝硬化组,但这并不影响本研究结论。

综上所述,IGFBP1在肝癌中的作用及机制可能是复杂的,但对于血清IGFBP1来说,肝癌患者血清中 IGFBP1水平升高对于肝癌的诊断和预测是有重要的临床意义的。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。