结直肠癌MMR表达与微卫星病灶状态及预后水平的关联研究*

韩金兰，张惠瑞

（河南省濮阳惠民医院 病理科，河南 濮阳 457000）

结直肠癌为临床常见消化道恶性肿瘤，多见于40岁以上中老年男性群体，相关研究数据表明，此病患病在所有恶性肿瘤中居第三位，病死率居第五位［1］。目前针对早期结直肠癌临床多以外科手术为主要治疗方法，而对于病情已进展至中期、晚期，且已错失手术最佳时机患者来说，含奥沙利铂的一线化疗更具临床优势［2］。尽管目前用于治疗中晚期结直肠癌的手术及化疗方案均已逐步成熟及规范化，但仍有部分患者治疗后远期生存率较低，常规治疗方法难以实现对肉眼无法察觉的微小转移病灶的有效治疗［3］。近年有研究指出［4-5］，基于遗传学改变的错配修复基因（MMR）表达缺失在结直肠癌的发病机制中有重要作用，与患者为微卫星病灶不稳定（MSI）也有密切关联。为进一步优化中晚期结直肠癌患者的临床治疗方法，本研究旨在分析MMR基因表达情况与微卫星病灶状态及预后水平的关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究以2020年7月至2022年7月河南省濮阳惠民医院收治的102例结直肠癌患者为研究对象，根据免疫组化检测结果，将入组患者分为MMR表达缺失组（dMMR组，42例）和MMR完全表达组（pMMR组，60例），两组患者一般资料比较见表1。本次研究已获得医院伦理委员会批准（T63738）。

表1 两组患者一般资料比较

纳入标准：①符合结直肠癌诊断要点［6］；②经临床评估确认为中期、晚期患者；③符合含奥沙利铂一线化疗指征且自愿接受化疗；④均已知悉此次研究试验目的及内容，同意获取并公开既往临床资料。

排除标准：①早期结直肠癌者；②参与本研究前1个月内接受过其他相关化疗者；③经临床评估预计生存周期不足1年者；④临床资料缺失者。

1.2 方法

MMR基因检测方法：①将病灶组织进行常规石蜡切片后予以脱蜡，加入0.01 mmol/L的柠檬酸钠缓冲溶液修复切片组织中抗原；加入浓度为3%的过氧化氢溶液（海德润制药，H11021382，3%）并于室温下孵育10 min，然后封闭内源性过氧化氢酶。②应用磷酸盐缓冲液对样本进行反复冲洗，后加入1∶10的MMR单抗稀释后孵育120 min；再次应用磷酸盐缓冲液（北京生物制品研究所，S10850002）反复冲洗并加入MMR单抗后再孵育30 min经磷酸盐缓冲液进行第3次反复冲洗后加入二氨基联苯胺［北京沃凯生物科技有限公司，沪食药监械（准）字2013第1401615号］进行原位杂交显色反应。③依次采用苏木素复染，经脱水、透明并应用中性树胶予以封片后，于显微镜下随机观察3个400倍视野，评估阳性细胞比例及染色强度，若肿瘤组织中无任何细胞核染色则判定为MMR表达缺失，反之则为MMR阳性。

含奥沙利铂一线化疗方法：首日取130 mg/m2奥沙利铂（深圳海王药业，H20031048，20 mL∶40 mg）加入至500 mL浓度为5%的葡萄糖溶液中稀释后经静脉持续滴注2 h；第1～5天按500 mg/m2剂量经静脉注射5-氟尿嘧啶，每3周用药1次；第1～14天按1 000 mg/m2剂量口服卡培他滨（上海罗氏制药，H20073024，500 mg），2次/d，21 d为1个周期，所有患者均连续治疗3个周期。

1.3 观察指标

①比较两组患者的一般资料、临床资料：一般资料包括性别、年龄、病程、疾病类型、病灶直径等；临床资料包括肿瘤分化程度（低分化、中分化、高分化）、肿瘤浸润深度（T1～T4）、肿瘤区域淋巴结受累情况（N0～N2）、肿瘤远处转移情况（M0、M1）［7］及微卫星病灶状态［微卫星病灶稳定（MSS）、微卫星病灶检测标志物<40%（MSI-L）、微卫星病灶检测标志物≥40%（MSI-H）］［8］。②结直肠癌MMR表达缺失的危险因素分析［9］：由于自变量、因变量间存在非线性关系，本研究将存在MMR表达缺失设为自变量，其余单因素设为因变量，将存在一定差异的单因素纳入Logistic多因素回归分析，当P<0.05时认为该因素为导致结直肠癌MMR表达缺失的危险因素。③预后情况评估：依据实体肿瘤疗效评估标准［10］，以靶病灶最大直径和为基数，若治疗后直径和较基线水平减小>30%时判定为完全缓解（CR），较基线水平减小20%～30%时判定为部分缓解（PR），较治疗前减小不足20%但病灶未生长时判定为病情稳定（SD），较治疗前病灶再次生长则判定为疾病进展（PD），CR、PR之和百分比记录为病灶客观缓解率（ORR），CR、PR、SD之和百分比记录为疾病控制率（DCR）；记录并对比两组随访期间的无进展生存率（PFS）、总生存率（OS）、中位PFS以及中位OS，自随机分化开始，任何原因导致患者病情进展记录为PFS，任何原因导致患者死亡记录为OS［11］。④MMR表达缺失与MSI及预后的相关性分析［12］：经Spearman相关性系数验证MMR表达情况与MSI、病灶ORR、DCR、中位PFS、中位OS的相关性。

1.4 统计学方法

数据均采用软件SPSS 22.0处理，计数资料以百分率（%）表示，比较用χ2检验，计量资料以均数±标准差（）表示，比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌MMR表达缺失的统计学单因素分析

统计学单因素分析结果显示，两组患者的年龄、病灶直径、肿瘤分化程度、肿瘤区域淋巴结受累情况、肿瘤远处转移情况及微卫星病灶状态均差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 结直肠癌MMR表达缺失的统计学单因素分析 ［n(%)］

2.2 结直肠癌MMR表达缺失的Logistic多因素回归分析

结合单因素分析结果，分别对P<0.05的单因素进行赋值，具体赋值情况见表3。

表3 各单因素赋值情况

Logistic多因素回归分析结果显示，年龄≥60岁、病灶直径≥5 cm、肿瘤低分化、区域淋巴结受累N0、肿瘤远处转移M0、MSI-L或MSI-H为导致结直肠癌MMR表达缺失的危险因素，见表4。

表4 不孕症的Logistic多因素回归分析

2.3 两组患者的MSI及预后情况比较

经含奥沙利铂一线化疗治疗后，pMMR组的ORR、DCR、中位PFS、中位OS均高于dMMR组，MSI低于dMMR组，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

表5 两组患者的预后情况比较

2.4 MMR表达缺失与MSI、预后情况的相关性分析

经Spearman相关性系数验证，MMR表达缺失与结直肠癌的ORR、DCR、中位PFS、中位OS负相关，与MSI表达正相关，见表6。

表6 MMR表达缺失与MSI、预后情况的相关性分析

3 讨论

结直肠癌为临床常见消化道恶性肿瘤，多见于中老年群体，近年随国内人口老龄化加剧，其患病率在逐步上升。目前针对早期结直肠癌，多以根治性手术为主要治疗方法，但对于病灶已发生明显浸润或远处转移的中期、晚期患者，临床更多会实施含奥沙利铂的一线化疗［13］。但实践表明［14］，因存在部分肉眼难以识别的微小转移病灶，部分患者经上述一线化疗治疗后的远期生存期仍处于较低水平，深入分析结直肠癌发病机制并探讨其机制中的可控环节并予以针对性治疗或可进一步增加患者临床获益。近年随分子生物学技术的不断进步及发展，临床逐步认识到了遗传学改变在结直肠癌发生及病情进展中的重要作用。

已有的研究证实［15］，结直肠癌的MMR表达缺失会导致微卫星病灶不稳定并增加微小病灶向远处转移、扩散风险，除会加大临床治疗难度外，还可能进一步提升病死风险。本研究结果显示，年龄≥60岁、病灶直径≥5cm、肿瘤低分化、区域淋巴结受累N0、肿瘤远处转移M0、MSI-L或MSI-H为导致结直肠癌MMR表达缺失的危险因素。目前已发现的与结直肠癌发病相关的MMR基因主要包括MLH1、MLH2、MSH6、PMS2等4种，当上述MMR基因表达均为阴性时则判定为MMR表达缺失［16］。目前认为，MMR表达缺失与肿瘤细胞的生物学特征存在密切关联，MMR基因表达缺失的结直肠癌患者预后相对较好，因此dMMR患者中大多区域淋巴结未受累且病灶未发生远处转移［17］。MMR基因能有效矫正DNA碱基错配并抑制基因突变，对预防肿瘤发生或恶变均有积极意义，但当MMR基因受外界生物因素及温度变化干扰时，则无法识别DNA复制时碱基错配并促使MSI发生［18］。MSI为基因上由多个重复单位组成的单核苷酸区域，广泛存在于人类基因组，其分布均匀，具有多态性、可遗传性等特征［19］。本研究中两组患者的统一经含奥沙利铂方案化疗后的预后情况、差异有统计学意义，dMMR组内患者多为高度MSI-H，其对应的ORR、DCR较pMMR组更低，中位PFS、中位OS较pMMR组更短，提示若结直肠癌患者伴有MMR表达缺失或MSI-H时不适宜应用一线化疗进行治疗。冯强等［20］研究指出，MMR表达缺失且伴高度MSI者对5-氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂在内的一线化疗似乎敏感性较低，该研究中，高度MSI患者应用FOLFOX4方案治疗后的病情复发时间较非MSI患者更短，提示此类患者对含5-FU及奥沙利铂的FOLFOX4化疗方法敏感性较差，且该学者认为，MMR蛋白的表达与MSI表达之间存在明显相关性。曾辉光等［21］也认为，MMR表达缺失所致MSI可对结直肠癌的5-FU基础化疗效果产生不利影响，为有效指导临床治疗，应将MSI作为其常规检测项目。而本研究经Spearman相关性系数验证，MMR表达与结直肠癌的ORR、DCR、中位PFS、中位OS正相关，与MSI表达负相关，也进一步证实了MMR表达与结直肠癌MSI及预后水平的关联。

综上所述，结直肠癌MMR表达缺失可导致MSI，dMMR及高度MSI会影响患者含奥沙利铂一线化疗效果，为增加患者临床获益并改善预后水平，应进行MMR及MSI检测并酌情调整治疗方案。