关于高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中β-激动剂类药物残留的研究

◎ 左 丹

（湖南省分析测试中心有限公司，湖南 长沙 410000）

1 实验部分

1.1 实验材料与设备

1.1.1 实验材料

牛肉：经检验β-受体激动剂呈现阴性的牛肉，绞碎均质。

1.1.2 主要试剂

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、高氯酸、氨水、氢氧化钠溶液、乙酸铵缓冲液、甲酸水溶液-甲醇溶液（体积比=90 ∶10）、β-葡萄糖醛酸酶（30 U·mL-1）。

对照品：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇（含量均≥98%）。同位素内标：莱克多巴胺-d3、克伦特罗-d9、沙丁胺醇-d3。

1.1.3 主要仪器设备

TSQ Quantis 型号高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）；分析天平；氮吹仪；水平振荡器；固相萃取装置等[1]。

1.2 混合对照品溶液及内标液的制备

准确称取莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇各10 mg,放置于100 mL 的棕色量瓶内，用甲醇定容，将其制备为0.1 mg·mL-1的混合对照品溶液，4 ℃避光保存备用，临用时可用甲醇稀释为所需浓度混合液。称取3 种同位素内标10 mg，同样的方法配置为100 μg·mL-1的储备液保存，用时可用甲酸水溶液稀释为100 μg·L-1的混合液，获得内标工作液[2]。

1.3 样品前处理

1.3.1 酶解和提取

称取新鲜或者冷藏解冻的试料2 g 置于50 mL 离心管内，加入0.2 mol·L-1的乙酸铵缓冲液6 mL、β-葡萄糖醛酸酶40 μl，涡旋均匀，于避光条件下37 ℃水浴振荡16 h，放至室温备用。

1.3.2 萃取、净化、浓缩

取上步骤获得备用液，加入100 ng·mL-1的内标液100 μL,涡旋均匀并在8 000 r·min-1的条件下离心8 min，取上清液，加入5 mL 高氯酸溶液（0.1 mol·L-1）,涡旋均匀，用高氯酸调节pH 至1，在8 000 r·min-1的条件下离心8 min，在获得的上清液中加入NaOH 溶液（10 mol·L-1）,调节pH 至10。加入乙酸乙酯15 mL，中速振荡5 min，在5 000 r·min-1的条件下离心5 min，获取上层有机相。对于上层水相，可加入叔丁基甲醚10 mL 进行提取，将前后2 次提取的有机相进行合并，50 ℃氮吹，并用甲酸溶液（2%）溶解备用[3]。

应用混合型阳离子交换固相萃取柱进行净化，分别用3 mL 甲醇及3%甲酸活化萃取柱后，备用液过柱后用2%甲酸与甲醇各3 mL 淋洗、抽干，用5%的氨化甲醇溶液3 mL 洗脱后50 ℃氮吹。

用0.5 mL 甲醇-1%甲酸溶液溶解残余物后过滤膜（0.22 μm 孔径），获得供试品溶液。

1.4 仪器条件

色谱柱：Waters C18 (Xbridge BEH 2.5 μm)；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；流速：0.2 mL·min-1；流动相：溶剂A+溶剂B。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相及梯度洗脱程序表

离子源：电喷雾（ESI+）；扫描方式：选择反应检测扫描（SRM）；离子喷雾电压：3 500 V；离子传输管温度：320 ℃；蒸汽温度：350 ℃；鞘气流速：40 Arb；辅助气流速：5 Arb。

2 结果与分析

2.1 酶解温度的优化

通过查阅相关文献得知，β-葡萄糖醛酸酶适用的温度处于40～110 ℃，于试料牛肉离心管内，加入0.2 mol·L-1的乙酸铵缓冲液6 mL、β-葡萄糖醛酸酶40 μL,涡旋均匀后分别于避光条件下37、45、53、61、69 ℃水浴振荡16 h，再经萃取、净化、浓缩后对3 种β-受体激动剂含量进行检测，结果见表2。

表2 不同酶解温度对β-受体激动剂测定结果的影响表

表2 显示,当酶解温度在37～45 ℃范围内时，3 种β-受体激动剂的测定结果差距不明显,均与推荐值最接近，随着温度的继续升高，在达到53 ℃后，测定值会有所降低，这可能因为温度过高会导致物质挥发丢失。所以，最合适的酶解温度为37 ℃[4-5]。

2.2 酶解时间的优化

设置样品酶解与提取前处理的酶解时间为37 ℃下水浴振荡8、12、16、20、24 h，再经萃取、净化、浓缩后对3 种β-受体激动剂含量检测，结果见表3。

表3 不同酶解时间对β-受体激动剂测定结果的影响表

表3 显示，酶解时间为8、12、16 h 时，β-受体激动剂含量测定值差距相对较小，均接近推荐值5 μg·kg-1，适合酶解时间为8 h。

2.3 净化条件的优化

应用SPE 技术净化，分别创建4 种淋洗液与洗脱程序，研究加标回收率，选择最佳净化条件，具体见表4。

表4 不同净化条件的β-激动剂回收率表

表4 显示，方法1 与方法2 下3 种β-激动剂的平均回收率差异性不大，分别为98.5%、98.4%。因此，该实验净化条件可以选择方法1 或者方法2。

2.4 方法回收率分析

各称取牛肉样品2 g，按照上述最佳前处理条件，分别添加不同梯度的3 种β-受体激动剂标准物质0、5、5、10 ng，并定容至1 mL，计算其分析结果及回收率见表5。

表5 3 种β-受体激动剂加标回收实验结果表

由表5 可知，β-受体激动剂化合物的加标回收率处于84.6%～97.2%，代表该检测方法具备较高的准确度，可以满足检测要求。

3 结语

本实验采用酶解与固相萃取的前处理技术和液质联用对牛肉中的3 种β-受体激动剂进行检测，发现最佳的酶解温度为37 ℃，酶解时间为8 h，净化条件如下。活化：3 mL 甲醇；3 mL 甲酸(3%)。淋洗：3 mL甲酸（2%）或者3 mL 高氯酸（0.1 mol·L-1）；3 mL甲醇。洗脱：3 mL 氨化甲醇溶液（5%）或者用代替淋洗中的甲酸，该方法具备较高的加标回收率，可检测牛肉中的“瘦肉精”药剂残留。