南瓜籽饼粕粉制备高含量蛋白肽的工艺优化分析

◎ 张良明，田 斌，苏亚庆

（西安天一生物技术股份有限公司，陕西 西安 710000）

南瓜籽是成熟南瓜的种子，其成分具有抗糖尿病、抗癌、改善前列腺增生的效果。研究表明，南瓜籽蛋白肽具有很好的抗氧化活性[1-3]。南瓜籽蛋白是南瓜籽榨油后的副产物——南瓜籽饼粕，其含有丰富的蛋白质、氨基酸、多种维生素、微量元素，营养丰富。以南瓜籽饼粕为原料，利用酶法，可以将蛋白质降解为小分子多肽。在蛋白质的水解中，需要采用专门的蛋白酶分解蛋白质，以水解蛋白质分子的肽链，生成多肽和氨基酸，使其成为具有良好溶解性、乳化性和生物活性的小分子肽，从而改善蛋白质的功能特性，将其更广泛地应用于普通食品和功能性食品中。通过有效控制蛋白质的水解程度，可以改善其乳化性能，更有利于氨基酸的吸收[4]。

基于此，本文通过正交实验，优选了南瓜籽蛋白肽的传统制备工艺。同时，通过膜分离技术对南瓜籽蛋白肽进行提纯，旨在促进南瓜籽蛋白肽更好地实现工业化生产，产生更高的经济效益。

1 材料与试剂

1.1 原材料与试剂

1.1.1 原材料

南瓜籽饼粕粉是西安天一生物技术股份有限公司自产的南瓜籽蛋白产品。以南瓜籽为原料，通过低温压榨，可得到南瓜籽油和南瓜籽蛋白饼粕；通过冲击磨超微粉碎南瓜籽饼粕，可得到南瓜籽蛋白超微粉产品。

1.1.2 试剂

盐酸、氢氧化钠三氯乙酸、硫酸铜、硫酸钾、硫酸标准滴定液、混合指示液、混合氨基酸标准溶液、柠檬酸缓冲溶液、pH 5.2的乙酸锂溶液、茚三酮溶液等；碱性蛋白酶（东恒华道生物科技有限公司）；风味蛋白酶（山东隆科特生物）；碱性蛋白酶、复合蛋白酶[诺维信（中国）生物技术有限公司]。

1.2 仪器与设备

雷磁PHS-3C pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、升降水油浴锅RE-501（西安予辉仪器有限公司）、低速大容量离心机TDL-5-A（上海安亭科学仪器厂）、旋转蒸发器RE-5210A 和RE-52A（上海亚荣生化仪器厂）、SHZ-95B 型循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器设备有限公司）、DZF-6050 真空干燥箱（上海琅轩实验设备有限公司）、电热鼓风干燥箱101-AB（天津市泰斯特仪器设备有限公司）、小型喷雾干燥机MAI-GZJ（上海那艾精密仪器有限公司）、K9840 自动凯氏定氮仪（山东海能仪器有限公司）、电子天平SQP[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

2 检测依据和实验方法

2.1 检测依据

按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品蛋白质的测定》第一法：采用凯氏定氮法进行干燥后，测定南瓜籽蛋白肽粉粗蛋白；采用GB/T 22492—2008附录B，测定南瓜籽蛋白肽粉肽含量。

2.2 南瓜籽多肽的制备工艺

南瓜籽蛋白超微粉→溶解预热→调节pH →调节温度→加酶水解→灭酶→离心→喷雾干燥或真空干燥→南瓜籽蛋白肽产品。

取100 g 南瓜籽蛋白粉，以一定比例加纯化水于四口瓶中配制南瓜籽蛋白溶液，持续搅拌，并进行预热处理30 min。将经过预热处理后的南瓜籽蛋白溶液调节pH 至反应所需的条件，以底物蛋白量添加不同的蛋白酶，搅拌，恒温水浴酶解，酶解结束后，升温至85 ℃灭酶30 min，冷却后放置4 ℃冰箱静置12 h，离心，将上清液进行减压浓缩，喷雾干燥或真空干燥，得到南瓜籽蛋白肽产品[5-10]。

2.2.1 多肽得率

多肽得率=（干燥产品中粗蛋白质含量/原料中粗蛋白质含量）×100%

2.2.2 蛋白酶的筛选

选用不同厂家不同型号的蛋白酶，分别对南瓜籽蛋白进行水解（蛋白酶添加量为1.2%），在每种酶的最适条件下进行实验，分别测定南瓜籽蛋白的水解度、多肽得率，平均实验3 次，取平均值，筛选出适合南瓜籽蛋白肽的蛋白酶种类。根据酶的说明书，与蛋白酶厂家技术人员沟通，确定不同蛋白酶的作用条件如表1 所示。

表1 不同蛋白酶的作用条件表

2.2.3 正交实验

在单因素试验的基础上，结合生产成本考虑，选取加酶量、pH、加水倍量、酶解时间为考察因素，以南瓜籽蛋白肽得率为指标，优选南瓜籽蛋白肽酶解最佳工艺条件，并对优选出的最佳条件平行进行3 次实验。

2.2.4 膜分离技术进行除杂，提纯南瓜籽蛋白肽的含量采用优选的南瓜籽蛋白肽酶解条件制备蛋白肽水解液，水解液经离心机5 000 r·min-1离心，获得小分子蛋白肽料液。将上述料液经陶瓷膜系统进行微滤，除掉悬浮物、菌体、大分子蛋白质，滤液澄清，将上述澄清滤液通过有机超滤膜系统进行分级纯化，除掉大分子蛋白、色素等杂质，提高产品纯度。接着，通过纳滤膜系统进行纳滤，脱除料液中的一价盐，对产品进行浓缩，并将上述截留液经喷雾干燥，设置进料温度160～190 ℃，塔内温度85～95 ℃，水分控制≤6.0%，得到南瓜籽蛋白肽产品，测定粗蛋白含量和蛋白肽含量[11-12]。

3 结果与分析

3.1 南瓜籽蛋白正交实验

设定温度55 ℃，酶解8 h，选取加酶量（A）、溶液pH（B）、加水倍量（C）3 个因素3 个水平进行正交实验，以蛋白肽得率为指标，实验设计见下表2、直观分析表见表3、效应曲线图见图1。

图1 效应曲线图

表2 南瓜籽蛋白肽正交实验表

表3 正交实验直观分析表

通过正交实验数据可以看出，加酶量是影响水解的关键因素，优选的蛋白肽水解条件为加酶量1.2%，pH=9，倍量16 倍，55 ℃水解8 h，之后进行灭酶，冷却后离心处理，清液干燥得南瓜籽蛋白肽产品。

3.2 不同厂家蛋白酶筛选

采用不同厂家的蛋白酶，酶添加量1.2%，pH=9，加水（纯化水）倍量12 倍，采用四口瓶水浴55 ℃搅拌水解8 h，对等量的南瓜籽蛋白进行酶解，不同厂家的蛋白酶得率见表4。

表4 不同厂家的蛋白酶选择表

以南瓜籽蛋白肽得率为指标，可以看出B 厂家的* 专用蛋白酶和C 厂家的碱性蛋白酶得率偏高，E 厂家的复合蛋白酶得率最高。为了使南瓜籽多肽具有更好的得率和更好的生物活性，选择B 厂家的* 专用蛋白酶和C 厂家的5# 碱性蛋白酶同A 厂家的风味蛋白酶进行复配，复配比例2 ∶1[13-15]。以优选的实验条件重复3 次实验进行验证，同E 厂家的复合蛋白酶开展蛋白肽得率验证实验，多肽含量计算平均值，样品粗蛋白含量和蛋白肽得率见表5。

表5 蛋白肽得率验证实验数据表

3.3 验证实验数据

由表5 可以看出，通过碱性蛋白酶和风味蛋白酶的复配，可以提高蛋白肽的得率，复配比例为2 ∶1，多肽得率为86.52%和86.18%，粗蛋白质含量均＞80%，多肽含量＞55%。

3.4 膜分离提纯除杂实验

根据上述优选的条件，通过复配的蛋白酶制备南瓜籽蛋白肽离心液，采用膜分离技术进行除杂，提纯南瓜籽蛋白肽的含量，表6 为进料液pH、温度及固形物浓度参数。

表6 进料液pH、温度及固形物浓度参数表

采用陶瓷-MF 进行膜过滤，运行时间：185 min；温度：43～46 ℃；压力：0.25～0.3 MPa，平均通量：61.5 L·min-1，45 Hz 的情况下通量随时间变化曲线，见图2。

图2 陶瓷膜膜过滤通量随时间变化曲线图

采用卷式超滤膜-1#UF 进行膜过滤，运行时间：135 min；温度：33～36 ℃；压力：0.65～0.85 MPa，过滤倍量：15 倍；平均通量：48 L·min-1，通量随时间变化曲线见图3。

图3 卷式超滤膜膜过滤随时间通量变化曲线图

通过上述陶瓷膜过滤、卷式陶瓷膜除杂、卷式纳滤膜浓缩后，蛋白肽固含量达17.8%，经喷雾干燥后检测产品粗蛋白含量为92.7%，多肽含量为81.8%，工艺重复2次，设备运行良好，蛋白肽含量均＞80%（以干基计），粗蛋白含量＞90%（以干基计），陶瓷膜过滤后，经纯化水顶洗收率达95%，卷式超滤膜收率93%以上。

4 结论及建议

本研究以低温压榨得到的南瓜籽饼粕，采用冲击磨粉碎后的南瓜籽蛋白超微粉，通过正交实验设计，得出南瓜籽蛋白制备南瓜籽蛋白肽的最佳制备工艺：加酶量1.2%，pH=9，倍量16 倍，温度为55 ℃，酶解8 h，该条件下，多肽得率＞85%，粗蛋白质含量≥80%，多肽含量≥55%。同时，本研究进行膜分离除杂提纯实验，得到最终产品粗蛋白含量≥90%（以干基计），多肽含量≥80%（以干基计）。结果表明，该制备工艺稳定、可行，可以获得一种简便易行、绿色环保、成本可控、溶解性好的高含量南瓜籽蛋白肽产品。因此，本研究结果可以为南瓜籽蛋白肽膜过滤浓缩除杂纯化方式提供数据支持。