肺炎克雷伯菌噬菌体裂解酶的研究进展

柳知君 李晓宇 徐永平 尹家俊 吴惧 王丽丽

摘要：随着耐药性肺炎克雷伯菌的增多，噬菌体的潜力逐步被发掘。裂解酶在噬菌体裂解宿主菌时起到了重要作用，作为外源纯化蛋白使用时，防控效果更为显著。现有研究中，针对革兰阳性菌噬菌体裂解酶的表达更多，因其不具有革兰阴性菌细胞壁外层的肽聚糖层，而对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌等革兰阴性菌的噬菌体裂解酶研究仍较为罕见。但已有研究表明，多种策略可以克服其肽聚糖层带来的阻碍。本文主要综述了近年来用于防控肺炎克雷伯菌的噬菌体裂解酶及其作用机制和防控优势，旨对其后续研究提供思路。

关键词：裂解酶；肺炎克雷伯菌；革兰阴性菌；噬菌体

中图分类号：R9文献标志码：A

Research progress of Klebsiella pneumoniae phage endolysin

Abstract With the increase in drug-resistant Klebsiella pneumoniae， the potential of bacteriophages has been gradually explored. Endolysin plays an important role in the lysis of host bacteria by bacteriophages， and the prevention and control effect is more significant when used as exogenous purified proteins. In the existing studies， the expression of phage endolysin for Gram-positive bacteria is higher， because it does not have the peptidoglycan layer of the outer layer of the cell wall of Gram-negative bacteria， and phage endolysin research on Gram-negative bacteria such as Klebsiella pneumoniae， Acinetobacter baumannii and Escherichia coli is still rare. However， studies have shown that multiple strategies can overcome the obstacles posed by its peptidoglycan layer. This article mainly reviews the bacteriophage endolysin used for the prevention and control of Klebsiella pneumoniae in recent years， their mechanism of action and prevention and control advantages in order to provide ideas for their follow-up research strategies.

Key words Endolysin; Klebsiella pneumoniae; Gram-negative bacteria; Phage

抗生素的濫用加速了抗生素耐药菌的出现[1]。抗生素的过度使用和误用导致耐药菌株的数量增多，包括多包括多重耐药（multi-drug resistant，MDR）、广泛耐药（extensively-drug resistant，XDR）甚至泛耐药（pandrug resistant，PDR）菌株[2]。迄今为止，面对肺炎克雷伯菌，即使是所谓的“最后一道防线”碳青霉烯类抗生素也被突破，对部分肺炎克雷伯菌已没有抑制作用。因此，寻找治疗耐药肺炎克雷伯菌感染的替代药物与策略变得不可或缺。在近期多重耐药肺炎克雷伯菌大幅增多的情况下，人们已将噬菌体裂解酶视为治疗临床感染的潜在药物[3]。裂解酶是噬菌体在其复制周期临近结束时用于从内部降解宿主菌肽聚糖的酶，导致细胞裂解并释放子代病毒粒子。重要的是，当作为外源性重组蛋白应用时，裂解酶也能够杀死易感细菌。特别是考虑到细菌对经典抗生素的耐药性已经出现并仍在蔓延，因此，噬菌体裂解酶作为潜在的抗菌药物引起了越来越多的关注。本文主要分析噬菌体裂解酶的治疗现状，并对目前防控肺炎克雷伯菌的噬菌体裂解酶进行综述，旨在为今后噬菌体裂解酶在控制耐药性肺炎克雷伯菌感染的应用中提供参考价值。

1 肺炎克雷伯菌感染现状

根据中国CHINET监测，2022年共收集临床分离菌339513株，其中肺炎克雷伯菌分离率（13.99%）位居第二，其中包括921株难治型耐药（DTR）肺炎克雷伯菌。2005—2022年连续18年的监测显示，肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率从最初的3.0%和2.9%已上升至2022年的22.6%和24.2%[4]。由于其遗传特性和分布的广泛性，在过去10年中，肺炎克雷伯菌已成为临床上主要的公共卫生威胁之一。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是1种重要的革兰阴性条件致病菌，集中存在于人和动物肠道、呼吸道、泌尿生殖道[5]，是住院患者耐药机会性感染的常见病因[6]。细菌可通过尿道或呼吸道进入血液循环或其他组织，进而引发多种感染性疾病，包括尿路感染、菌血症、肺炎和肝脓肿等[7]。在抗生素前时代，肺炎克雷伯菌是社区获得性肺炎（CAP）的重要病原体，尤其是在糖尿病患者和酗酒者中。在随之而来的抗生素时代，它成为院内相关医疗感染的主要原因[8]，并且是社区获得性感染的危险因素[9]。在中国，呼吸机相关性肺炎（VAP）和重症监护病房（ICU）的获得性肺炎分离病原菌中，肺炎克雷伯菌占11.9 %[10]。ICU获得性肺炎和VAP的发病率分别为16.2%和33.7%；死亡率分别为37.4%和34.5%。如此高的发病率和致死率向医院的应对策略和国家的卫生系统发出了警告。相比之下，医源肺炎克雷伯菌株耐药率显著高于动物源菌株，在动物源菌株中，鸡源和猪源菌株耐药率高于兔源和犬源菌株；除犬源菌株外均表现多重耐药。在抗生素的使用上，一些新颖且昂贵的药物很少被用于动物体内肺炎克雷伯菌引发的疾病治疗，因此对其耐药性较低[11]。

肺炎克雷伯菌对青霉素具有天然耐药性，且种群成员通常对多种抗菌素具有获得性耐药性[6]，导致多重耐药（MDR）和高毒力肺炎克雷伯菌株（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hv KP）在地理上更加快速的传播。目前，临床上常使用β-内酰胺类抗生素进行治疗，然而，肺炎克雷伯菌毒力和抗生素耐药性的详细机制目前仍不是十分清楚。Hv Kp高毒力表型的遗传因子存在于一个大的毒力质粒上，其感染常发生在多个部位，并随之扩散，给控制和治疗增加了难度[7]。变异株hv Kp最早发现于太平洋圈，可导致社区获得性、侵袭性和转移性糖尿病感染或免疫功能正常的年轻人肝脓肿、眼内炎、脑膜炎和化脓性关节炎[12–14]。

MDR菌株的出现和传播是肺炎克雷伯菌领域需解决的首要问题。因为碳青霉烯类抗生素的使用增 加，由产超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）肺炎克雷伯菌进化而来的MDR菌株随之增多。其中有几个独立进化的遗传元件使菌株具有碳青霉烯类抗生素耐药性。携带致病基因CTX-M-15的肺炎克雷伯菌在世界各地蔓延，与医院感染和最近的社区获得性感染的发病率和死亡率增加有关[15–18]。MDR肺炎克雷伯菌的耐药特性与质粒编码的耐药基因（ARGs）密切相关。在质粒和可转移的遗传元件的帮助下，肺炎克雷伯菌会在抗生素使用不当的情况下持续积累ARGs，导致出现具有”超级耐药基因组”的 XDR 菌株[19]。

2 噬菌体裂解酶

裂解酶是一种噬菌体编码的在肽聚糖的破坏过程中引起细胞裂解的蛋白质[20]，在感染的宿主细胞内于噬菌体裂解周期结束时产生，在穿孔素的帮助下使宿主细胞破裂。穿孔素产生于感染的后期，一旦达到临界浓度，便会通过齐聚反应在细胞膜上产生孔洞，允许已经在细胞质中积累的裂解酶触及到肽聚糖的基层[21]。裂解酶逐渐积累后从内部发生酶促反应降解细菌肽聚糖，导致细胞裂解的同时释放子代噬菌体[22]。噬菌体基因组测序产生的丰富数据为裂解酶检测系统提供了更多可能，且由于致病菌中抗生素耐药性的急剧增加，裂解酶近年来作为潜在的抗菌剂引起了越来越多的关注[23-24]。

2.1 肺炎克雷伯菌噬菌体裂解酶

噬菌体控制着细菌种群，对细菌生态系统有很大的影响[25]。随着噬菌体的发展，噬菌体裂解酶疗法应运而生。第一个噬菌体裂解酶是在20世纪50年代发现的[26]，但是该裂解酶仅对死细胞有作用，对活细胞无效果。噬菌体利用裂解酶来消化宿主细菌细胞壁以释放子代噬菌体[27]，由于其作为纯化蛋白在体外应用时能够有效地杀死抗生素耐药的病原体，因此裂解酶作为替代抗菌剂获得了越来越多的关注，在体外和动物模型中被认为是治疗革兰阳性菌病原体的有效抗菌剂[28-29]。然而，革兰阴性菌细胞壁具有外膜[30]，在没有膜融合蛋白的情况下通常会阻碍裂解酶进入肽聚糖层发挥作用[31]。因此，对于革兰阴性菌尤其是肺炎克雷伯菌的治疗现状，迫切需要具有较强裂解能力的裂解酶。噬菌体来源的重组蛋白可以直接用于对抗由肺炎克雷伯菌等细菌引起的感染，或者作为加强现有抗菌制剂的组合方法的一部分[31]。

Wei等[32]将肺炎克雷伯菌Kp3与终浓度为2 mg/mL的噬菌体裂解酶PlyKp3共孵育后，A600值由2.5降至0.5，活菌数由1.0×109 CFU/mL降至4.0×108 CFU/mL，光镜及透射电镜下观察，细菌原有形态消失。PlyKp3展现出对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌等革兰阴性菌的广谱抗菌性，有望成为抗革兰阴性菌的新药物。Maciejewska等[33]从肺炎克雷伯菌噬菌体KP27中表达了一种重组裂解酶，并将其与肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌进行共培养，细菌外膜均经过透化处理后，发现重组裂解酶可成功裂解所有供试菌株。后续实验中，测试到极端温度和pH条件下KP27裂解酶的高稳定性与适用性，这值得特别关注。迄今为止，仅有少数热稳定性裂解酶被发现[34-35]。KP27对PAO1菌株[36]的抗菌活性是HEWL的3倍以上，且对人源细胞A549无毒性，证明了其作为抗菌剂的高效性和潜在安全性。Lu等[37]将肺炎克雷伯菌噬菌体MK54 裂解酶LysG24与抗菌肽天蚕素A残基连接构成新的肽修饰裂解酶LysCA。结果表明，LysG24和LysCA的裂解谱均比噬菌体MK54宽。在体外试验中，两种裂解酶均在6 h内破坏了99%的宿主菌，但LysCA的裂解能力和环境适应性显著强于LysG24。在体内试验中，根据临床症状和肺部病理切片结果可知，LysG24和LysCA均能有效降低感染肺炎克雷伯菌小鼠肺部炎症反应，可有效抑制体内宿主菌LPKP的生长，减轻肺组织炎症，且安全性试验表明裂解酶对小鼠无毒性作用。因此，LysG24和LysCA在体内外均表现出优异的抗菌活性，安全性高，对环境的适应性强，具有作为新型抗菌剂的潜力。

2.2 噬菌体裂解酶的优势

相比于噬菌体与抗生素，噬菌体裂解酶具有很大的优势。与噬菌体相比，首先，裂解酶裂解谱宽，而噬菌体宿主特异性强，会限制其应用范围。其次，裂解酶作用速度更快。第三，裂解酶可以通过基因工程技术大量制備[38]。第四，裂解酶制剂可以确保无细菌与细菌毒素。但是噬菌体具有自限性，即需要宿主不断生长，作为病毒粒子难以管理。噬菌体制剂若想达到同样目的，将会增加生产成本和技术挑战[2]。第五点也是最需要考量的，与噬菌体疗法相比，裂解酶有一项明显的优势，在欧盟和英国，用于人类的重组蛋白产品在生产、安全和使用方面有明确和既定的规章制度，而噬菌体疗法则没有[31]。

多项研究报道，相比与抗生素，细菌对裂解酶产生耐药性的可能性更小[39–41]。与经典抗生素相比，裂解酶的一个重要优点是它对部分肽聚糖类型具有高度特异性，这通常限制了它对某些细菌属、种甚至血清型成员的抗菌作用[42-43]。这种近物种特异性大大降低了因常使用广谱抗生素导致的耐药菌株或共生菌株产生的风险，允许选择性地杀死特定的目标病原体，伴随微生物群的共生细菌或所需生物不受影响[44]。

2.3 作用机制与结构

根据破坏肽聚糖的机制不同，噬菌体裂解酶可分为以下5种：①氨基葡萄糖苷酶，切割β-1，4-乙酰壁胺键；②溶菌酶，水解肽聚糖主链中N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNAc）之间的β-1，4糖苷键；③裂解性转糖基酶，切割键与溶菌酶相同；④内肽酶，裂解干肽或肽间桥的氨基酸；⑤酰胺酶，水解肽段和糖之间的酰胺键[23，45-46]。

由于细菌类群之间细胞壁结构的差异，噬菌体裂解酶的结构在针对革兰阳性菌和革兰阴性菌二者并不相同[23]。抗革兰阳性菌的裂解酶已经进化到使用模块化设计，其中催化活性和底物识别被分为两种不同类型的功能域，称为细胞壁结合域（cell wall bingding domains，CBDs）和酶活性域（enzyme activity domains，EADs）[24]。然而，感染肺炎克雷伯菌等革兰阴性宿主菌的噬菌体裂解酶大多是分子量在15～

20 kDa之间小的单结构域球状蛋白，通常没有特定的CBD模块[47-48]，裂解酶的催化功能域一般位于C端，而细胞壁结合功能域则位于N端，有些裂解酶拥有2个甚至3个不同的催化域[49]。革兰阴性菌的外膜利用肽聚糖层防止周围完整细胞的扩散和尚未被噬菌体感染的细胞被破坏。在公共数据库中记录的裂解酶结构体系是多种多样的，并不仅限于上述两个模块[50]。

2.4 改善策略

肽聚糖等保守结构的裂解表明裂解酶是抗多重耐药革兰阴性菌的有前途的抗菌药物[20]。噬菌体裂解酶从细胞内部开始活跃，噬菌体编码的辅助蛋白帮助细胞质膜输出到肽聚糖层[51-52]。尽管与使用噬菌体以及抗生素相比具有一些优势，但由于革兰阴性菌外膜的低渗透性，外源性应用噬菌体裂解酶仍相对困难[53]，一些裂解酶仍需要额外的策略帮助渗透外膜。

有多种策略已被证实可以克服革兰阴性菌噬菌体裂解酶的缺点[2]。首先，EDTA常被用于外膜透化的处理。分别来自肺炎克雷伯菌噬菌体K11和Kp32的裂解酶K11 gp3.5和Kp32 gp15在0.5 mmol/L EDTA的帮助下对PAO1的抗菌活性显著增加[54]。来自沙门菌噬菌体SLMP1的裂解酶LysSP1在5 mmol/L EDTA的帮助下对革兰阴性菌和革兰阳性菌表现出非常广阔的裂解谱[55]。其次，在弱有机酸的存在下，裂解酶表现出更多更广泛的抗菌活性。鲍曼不动杆菌噬菌体裂解酶ABgp46在3.65 mmol/L柠檬酸和4.55 mmol/L苹果酸的辅助下可快速杀灭鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门菌[53]。第三，替换氨基酸可提高裂解酶的抗菌活性。将3～12个疏水性氨基酸成功添加到大肠埃希菌噬菌体裂解酶Lysep3的C端后，修饰后的Lysep3能够从细胞外杀死大肠埃希菌[56]。第四，为了克服在治疗革兰阴性菌感染时需要额外的外膜渗透剂，通过基因工程手段将噬菌体裂解酶与外膜去稳定肽融合，使裂解酶通过外膜屏障，增加裂解活性，开发人工裂解酶[57]。最近，为了治疗感染，将穿孔素（holin）和一段多肽融合到幽门螺旋杆菌噬菌体的裂解酶中，创造了一种新的人工裂解酶[57]。针对肺炎克雷伯菌的人工裂解酶尚待开发，但已成功存在作用于幽门螺旋杆菌[57]、铜绿假单胞菌[58]和鲍曼不动杆菌[59]的人工裂解酶。该技术为开发治疗MDR肺炎克雷伯菌和MDR革兰阴性菌感染的人工裂解酶开辟了可能性[31]。第五，裂解酶直接与抗菌肽（AMPs）融合。Peng等[60]研究团队基于鲍曼不动杆菌噬菌体Ф AB2编码的裂解酶Lys AB2的C端两亲螺旋区合成了4个AMPs。这些多肽对鲍曼不动杆菌（MIC为4～64 μmol/L）表现出较强的抗菌活性，此外，在小鼠腹腔感染模型中，细菌注射4 h后，LysAB2使腹腔液中的细菌量降低了13倍，血液中的细菌量降低了27倍。最后，裂解酶可以通过包封在阳离子脂质体中传递。例如，沙门菌噬菌体裂解酶BSP16Lys被二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和十六胺组成的脂质体包裹后，更易穿透革兰阴性菌外膜，从而抑制鼠伤寒沙门菌和大肠埃希菌的生长[61]，这表明了脂质体介导的裂解酶传递具有外源性抗革兰阴性菌的潜力。

3 噬菌体裂解酶商业化的挑战

3.1 规模化生产与配方

噬菌体裂解酶作为抗菌剂的广泛使用需要大规模生产和适当纯化这些蛋白。在此背景下，从实验室规模转化为大规模生产必须克服的两个主要困难是总生产成本和安全问题。大肠埃希菌是用于重组蛋白表达的最常见的细菌[62]。或者，利用甲基营养型毕赤酵母或一些丝状真菌可以获得较高的重组蛋白产量[63]。此外，用于治疗应用的蛋白质的另一个重要问题是纯化程度。蛋白质必须高度纯化，尤其是肠外给药的蛋白质，并且这些蛋白质的悬浮液必须是无菌产品。最后，制备含裂解性蛋白的治疗性化合物仍面临很大挑战，如蛋白在储存条件下的稳定性、与给药途径的相容性、降低免疫原性等。因此，存在添加一种或多种聚合物的构想以避免蛋白质聚集[65]。总的来说，参考之前治疗蛋白商业化的成功案例，肺炎克雷伯菌噬菌体裂解酶的生产和配方问题似乎在不久的将来也将很容易解决。

3.2 监管框架

迄今为止，在欧洲或美国还没有噬菌体裂解蛋白被接受用于人类治疗。唯一的例外是Staphefekt，它是第一个以“医疗器械”的身份在欧盟批准上市的裂解酶产品[65]。除此之外，噬菌体裂解蛋白可能被批准为“生物治疗蛋白”，因为它们表现出与已经商业化的其他重组蛋白相似的特性[66]。幸运的是，这似乎比授权噬菌体所必需的路径更短，因为目前没有法律框架允许公司将用于人类治疗的噬菌体产品投放市场[67]。肺炎克雷伯菌的防控是一項系统性工程，噬菌体裂解酶制剂作为一种极具潜力的治疗手段仍面临许多监管上的约束，但经过更深入的研究和讨论，裂解酶产品用于临床治疗指日可待。

4 总结与展望

噬菌体裂解酶作用于细菌细胞壁的肽聚糖层，最终破坏细菌细胞壁，导致菌体破裂。肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药性日渐加强，MDR肺炎克雷伯菌的感染趋势正在全球范围内扩大，裂解酶作为一种生物蛋白，可以单独或与其他抗菌剂联合使用作为一种极具潜力的抗菌武器。但是，对于如何完善裂解酶的作用方式以及生产工艺仍有很多研究有待开展。今后可从分子生物学角度改造裂解酶，拓宽裂解谱，从基因水平提高其裂解能力。裂解酶的长期保存、给药方式、生产模式等问题仍有待解决。

参 考 文 献

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