他克莫司的分离提纯研究

2024-05-03王圆超赵辉王月谷岩翡高月麒李晓露

中国抗生素杂志 2024年2期

王圆超赵辉王月谷岩翡高月麒李晓露

摘要：目的开发一种他克莫司的分离提纯工艺。方法采用离子交换树脂脱色除杂、纳滤、结晶等手段得到高质量的他克莫司粗粉，再经反相色谱硅胶层析、复合溶液结晶，得到符合USP标准的他克莫司精粉。结果优选的脱色树脂为D002，所得他克莫司粗粉效价大于800 μg/mg，二氢他克莫司含量小于4%；该粗粉经UniSil C8 Ultra Plus层析纯化，精粉含量大于99.5%，最大单杂小于0.1%。结论该工艺操作简单、能耗低、收率高，适于他克莫司的产业化应用。

关键词：他克莫司；分离提纯；离子交换树脂；层析；结晶

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Studies on the separation and purification of tacrolimus

Abstract Objective The purpose of this study is to develop a separation and purification process for tacrolimus. Methods Tacrolimus coarse powder with high purity was obtained by ion exchange resin decolorization， nanofiltration and crystallization， which was further refined by reverse phase chromatography silica gel chromatography and composite solution crystallization to obtain the tacrolimus product that can meet USP standards. Results The optimized decolorizing resin was D002. The titer of the tacrolimus coarse powder was more than 800 μg/mg and the purity of the dihydro-tacrolimus was less than 4%. Then we continued to purify the coarse powder using UniSil C8 Ultra Plus chromatography to obtain the fine powder. And the purity of the tacrolimus fine powder was more than 99.5%; the maximum single impurity substance was less than 0.1%. Conclusion This method had the characteristics of simple operation， low energy consumption and high yield， which were of great significance to the industrial production of tacrolimus.

Key words Tacrolimus; Separation and purification; Ion exchange resin; Chromatography; Crystallization

他克莫司（tacrolimus，又名FK506），是由筑波链霉菌发酵产生的一种大环内酯类抗生素，1993年获批上市，分子式为C44H69NO12，分子量：804.03，结构式如图1所示，为白色或类白色结晶性粉末[1]。他克莫司是一种强效的新型免疫抑制剂，可用于肝移植、肾移植和骨髓移植等手术术后的排斥反应治疗[2]。其免疫抑制作用较环孢素（CsA）强100倍，因此在降低临床使用剂量的同时，可大大减少不良反应。此外，他克莫司也可用于治疗特应性皮炎、系统性红斑狼疮和自身免疫性等疾病[3]。

他克莫司可通过微生物发酵进行规模化生产，其发酵液中除目标产物外，还含有油脂、有机色素及他克莫司类似物，包括二氢他克莫司（FK+2）和子囊霉素（FK520）等杂质[4]。工业上高纯度的他克莫司主要通过预处理后的粗粉经过柱层析的方法获得[5-6]，因此粗粉的纯度直接影响着他克莫司产品的质量。目前，关于大孔吸附树脂或改性硅胶吸附分离他克莫司的研究较多[7]，但大多工艺繁琐，能耗高，粗粉质量低。温耀明等[8]使用中型高速逆流色谱法，提高了他克莫司粗粉质量，但需要特殊设备，存在着纯化收率低和工业化成本高的问题。吴振强等[9]将溶剂萃取和超临界流体萃取相结合，从发酵菌丝体中提取他克莫司，此法提高了产品收率，但消耗大量溶剂，能耗高，环境污染严重。高庆峰等[10]采用复合型活性炭脱色除杂的方法纯化他克莫司，避免了吸附解析步骤，减少了溶剂的使用，但未能得到高纯度的他克莫司样品，无法满足高纯度他克莫司产品的需求。因此，本领域亟需一种工艺简洁、生产周期短、纯度及收率高、绿色环保的他克莫司生产工艺。

本研究选用离子交换脱色树脂，对他克莫司浸提液进行了净化处理，在去除有机色素的同时，有效降低了发酵副产物杂质的比例，继而通过纳滤、萃取、结晶的方式，制备得到了高质量的他克莫司粗粉；再经反相硅胶色谱层析、结晶等方式，得到颗粒均匀、质量稳定的他克莫司原料，为该产品通过国际高端认证、拓展高端市场奠定了基础。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

他克莫司发酵液（单位1617 μg/mL）由华北制药华胜有限公司提供；分析纯乙醇、乙腈、正庚烷购自天津市永大化学试剂有限公司；分析純乙酸乙酯、异丙醚购自天津市科密欧化学试剂有限公司；分析纯甲醇购自成都市科隆化学品有限公司；90-772型药用活性炭购自浙江杭木活性炭有限公司；超纯水由Rephile纯水仪制备。

D002、D290树脂购自上海逊尔化工科技有限公司；氧化铝购自国药集团化学试剂有限公司；UniSil C18、UniSil C8 Ultra Plus、UniSil C8型反相色谱硅胶购自苏州纳微科技股份有限公司。

1.2 仪器

Loborata 4000型旋转蒸发器（Heidolph公司）；JM1812-1卷式膜小型实验机（大连屹东膜工程设备有限公司）；LC-2030C 3D型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；有机膜（天津膜天膜科技股份有限公司）。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：B=49：51，流动相A为水：四氢呋喃：磷酸=3000：600：0.8，流动相B为乙腈：四氢呋喃：磷酸=3000：600：0.8；流速1.0 mL/min；检测波长210 nm；进样量20 μL。

2.2 他克莫司粗粉制备

发酵液减压抽滤，得到菌丝。菌丝中加入1倍发酵液体积的乙醇溶液搅拌浸泡2 h，抽滤得到浸提液。将浸提液调酒精度至45%～50%，上样于脱色介质除杂，透过液纳滤浓缩得到浓缩液。乙酸乙酯萃取浓缩液1次，碱洗乙酸乙酯相2次后，萃取液浓缩至油膏状，加入异丙醚结晶，结晶液过滤干燥后得到他克莫司粗粉。

2.3 他克莫司精粉制备

他克莫司粗粉用乙醇溶解，上样于反相色谱硅胶中，使用有机溶液解析，分段收集解析液，合并含二氢他克莫司＜0.1%、子囊霉素＜0.1%的解析液。解析液减压浓缩后加入乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩干燥后，加入极性溶剂，搅拌结晶，然后过滤、干燥，得到他克莫司精粉。

3 结果与讨论

3.1 浸提溶剂的选择

由于他克莫司为胞内产物，所以要选择合适的浸提溶剂将他克莫司从胞内提取出来。他克莫司易溶于甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯，微溶于己烷和石油醚，难溶于水[11]。乙醇毒性小，易于放大生产，因此选择乙醇作为浸提溶剂，考察了乙醇浓度对浸提效果的影响。如图2所示，当乙醇浓度为90%时，浸提效果最好。

3.2 脱色除杂参数的选择

3.2.1 脱色介质的优选

他克莫司浸提液为棕褐色，颜色较深，且其中杂质含量（FK+2和FK520，下同）较高。如能在粗粉制备阶段除去大部分杂质，则可提高粗粉质量，也可为制备高纯度精粉奠定基础。如表1所示，浸提液通过Al2O3与D290树脂后，他克莫司浓度降低幅度虽较小，但树脂对色素、杂质等吸附能力较弱，脱色效果差。活性炭对他克莫司的吸附能力很强，造成了极大损失。而经过D002离子交换树脂的浸提液中杂质含量明显降低，且D002离子交换树脂对他克莫司的吸附性小，脱色液的颜色也较浅，故选择D002树脂作为他克莫司浸提液的脱色介质。

3.2.2 洗脱流速的优选

考察不同流速下D002离子交换树脂对他克莫司浸提液的脱色效果，如表2所示。结果表明，不同流速下透过液中他克莫司浓度变化不大。当流速较低时，杂质含量低，但脱色效率低；而过高的流速会使杂质含量升高。当流速从0.5 BV/h升至1 BV/h时，透过液中杂质含量变化不大；当流速继续升至1.5 BV/h时，透过液中杂质含量明显升高，脱色液颜色变深。因此，选择1 BV/h为最佳上样速度。

3.3 纳滤膜型号的选择

纳滤膜可截留大量亚微粒及大分子物质，改善料液的透光度，降低相对密度，从而提高结晶收率，加快结晶过滤速度[12]。而且采用纳滤浓缩取代传统减压浓缩，可有效降低能耗，提高浓缩效率。因此对不同截留分子量纳滤膜的截留效果及浓缩时间进行了考察，结果如图3所示。截留分子量为200～300 Da时，截留率高，但浓缩时间较长；截留分子量为700 Da时，浓缩时间短，但截留率低。综合考虑，选择截留分子量为500 Da的膜对脱色液进行纳滤浓缩。

3.4 层析参数的选择

他克莫司发酵液经离子交换树脂脱色除杂、纳滤、结晶等方法分离纯化后，可以得到效价大于800 μg/mg，最大单杂小于4%的他克莫司粗粉。为获得高质量的他克莫司精粉，本文采用反相色谱硅胶层析、结晶技术对粗粉进一步提纯。

3.4.1 层析介质的优选

考察UniSil C18、UniSil C8 Ultra Plus和UniSil C8 3种反相色谱硅胶的分离效果，结果如图4所示，其中UniSil C8 Ultra Plus型色谱硅胶FK506含量、收率最高，故选择UniSil C8 Ultra Plus型反相色譜硅胶为层析介质。

3.4.2 洗脱溶剂的优选

乙醇、甲醇、乙腈均可将他克莫司从反相色谱硅胶中洗脱下来，如图5所示，乙腈洗脱时溶剂用量少，但FK506含量及收率低；而甲醇、乙醇洗脱时，FK506含量、收率、洗脱液体积均相差不大，但考虑到溶剂毒性，工艺放大生产的安全性等因素，综合评估后选择乙醇作为洗脱溶剂。

3.4.3 上样量的优选

考察不同上样量对于层析效果的影响，结果如图6所示，其中上样量为8 mg/mL时FK506含量、收率最高。因此上样量选择为8 mg/mL。

3.5结晶溶剂的选择

药物的固体形式（结晶形或无定形）对药物的性质和后续产品的性能有较大影响[13]。在药物结晶时，溶剂的种类和浓度会影响结晶过程，进而影响其固体形式[14]。因此，本研究选择不同溶剂进行了结晶实验。如图7所示，当单独使用异丙醚、正庚烷作为结晶溶剂时，结晶粉中FK506含量较低。若使用复合溶剂，结晶粉中FK506含量得到较大提升。其中异丙醚-水、异丙醚-乙酯-水作为结晶溶剂时，FK506含量较高。但异丙醚-乙酯-水作为结晶溶剂时，FK506结晶收率较低。而异丙醚-水作为结晶溶剂时，FK506含量、结晶收率均较高，且结晶粉为片状结晶，颗粒均匀，如图8所示。因此，选择异丙醚-水作为他克莫司的结晶溶剂。

3.6 工艺验证

按照确定的工艺条件，进行连续3批的重复实验，如表3～4所示。在本实验优选工艺参数下可得到效价大于800 μg/mg的他克莫司粗粉，二氢他克莫司小于4%；所得他克莫司精粉含量大于99.5%，最大单杂小于0.1%。本工艺稳定性高、重现性好，可实现产业化应用。

4 结论

他克莫司是继环孢素后开发的一种大环内酯类抗生素，是目前临床上最为看好的强效免疫抑制剂之一。本文以他克莫司发酵液为原料，利用离子交换树脂脱色除杂、纳滤浓缩与层析纯化技术等，得到了含量大于99.5%，最大单杂小于0.1%的他克莫司精粉。该工艺从源头上降低了有机色素等杂质的干扰，提升了粗粉质量，进而稳定提高了精制效率，更好保证了产品质量。与现有提取技术相比具有纯度及收率高、溶媒用量少、环境污染小等特点，实现了他克莫司的技术指标提高和生产环境优化，对其工业化生产具有重要意义。

参考文献

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