基于网络药理学和分子对接探讨六君子汤治疗胃肠功能障碍的作用机制※

辛交莲 龙凯澳 邓 彪，2 李振龙，2▲

胃肠功能障碍（gastrointestinal dysfunction，GID）常出现在危重患者中，且与临床预后较差相关，是一组涉及胃和肠道的功能性疾病，无明显的器质性病变，可涵盖运动和/或吸收障碍、免疫屏障受损、微生物组变化和灌注受损等。GID主要症状包括腹痛、腹胀、呕吐、便秘、腹泻等，甚者出现肠梗阻、应激性溃疡伴出血等。GID发生机制尚不明确，可能与神经肌肉活动失调、菌群稳态被破坏、免疫系统等相关，多继发于严重感染、神经功能障碍等[1-2]。在脓毒症患者中，其发病率约为78.8%，病死率过半[3]。目前，GID 的药物治疗主要包括护胃、抗胃肠痉挛、改善肠道菌群、促进胃动力恢复等对症治疗。根据中医辨病方法划分，GID 归 属 于 中 医 学“痞 证”“腹 胀”“胃 痛”“泄 泻”“痞满”等范畴，其病机为气机逆乱、升降失常[4，5]，临床上以老年人最为多见，危重患者尤甚。该病多为本虚标实之证，其中脾胃气虚为其发病基础，疾病早期多以气滞腑实为标，疾病中期多以瘀热内结为标，疾病晚期多以湿浊内阻为标，治疗上常以补虚为主、泻实为辅，健脾和胃贯穿治疗的始终[6]。六君子汤出自《医学正传》，由四君子汤加陈皮、半夏组成，被广泛用于治疗脾胃虚弱所导致的消化不良、食欲不振、腹胀等。本方中以党参替人参，同样具有益气健脾、燥湿化痰的功效，在临床实践中已得到疗效证实[7-9]。

多靶点作用是中草药治疗疾病的特点，其多成分作用的复杂机制，可通过网络药理学研究，构建生物分子信息网络，更好地诠释中药的复杂作用机制。分子对接技术通过模拟相互作用状态，以预测药物的活性和作用机制，同时可节省实验时间和成本。本研究通过结合使用网络药理学和分子对接技术，可灵活地实现不同类型中药成分作用于不同靶点状态的可视化，探究六君子汤治疗GID 可能存在的分子作用机制。

1 方法

1.1 筛选六君子汤药物活性成分及相关靶点运用R 软件运行程序于中药系统药理学数据库和分析平台（TCM-SP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索，以口服生物利用度（oral bioavalability，OB）≥30%、分子类药性（drug like，DL）≥0.18 为限定条件进行筛选，获得六君子汤中6味中药的活性成分，并根据所得活性成分在TCM-SP 中找出相应靶点。为便于后续的数据分析，在UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）中检索筛选出的靶点蛋白，即在Uniprot 搜索栏中直接点击Search，切换界面后于左侧边栏依次点击“Human”“Reviewed（Swiss-Prot）”，然后在自定义栏目“Customize columns”中加入限定条件“Gene Names（primary）”，最后“Download”所筛选出靶点蛋白的Excel 表格，使用基因名（gene name）将靶点蛋白进行统一转化，规范命名。

1.2 GID 相关靶点检索在DisGeNET 数据库（https：//www.disgenet.org/）、GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）和OMIM 数 据 库（https：//www.omim.org/）中，以“Gastrointestinal Dysfunction”为关键词检索，将所得靶点蛋白存入Excel进行合并去重，获得GID的疾病作用靶点。

1.3 获取六君子汤-GID 交集靶点通过上述步骤得到药物靶点与疾病靶点后进行整合，然后导入VENNY 2.1 网 站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny） 获取交集靶点，可通过绘制韦恩（Venn）图以实现交集靶点的可视化。

1.4 六君子汤-成分-靶点蛋白-GID 互作网络图构建及PPI 网络分析上述筛选出的药物活性成分及其靶点，运用Cytoscape 3.10.0 软件，构建“六君子汤-成分-靶点蛋白-GID”网络图，即药物活性成分-靶点蛋白-疾病互作图。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析首先由韦恩图所得靶点上传至STRING网站后，勾选“最低要求的互动分数（minimum required interaction score）”为“high confidence（0.9）”，其他设置选择默认，然后进行分析，再导出PPI 互作网络分析图及tsv 文件，最后利用Cytoscape 3.10.0中Network Analyzer 分析PPI 网络，筛选其中的重要靶点。

1.5 基因本体和京都基因与基因组百科全书通路富集分析利用六君子汤及GID交集靶点，对所得的核心靶点通过基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）进行通路富集分析，将核心靶点上传至微生信网络分析平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/），分析后可得分子功能（molecular functions，MF）、细胞组成（cellular components，CC）、生物过程（biological processes，BP）和KEGG 富集通路，导出可视化结果。

1.6 分子对接由pymol 软件将配体和受体进行修饰，运用AutoDock（一种分子建模模拟软件）进行半柔性对接，以反向验证六君子汤药物活性成分与核心靶点之间的作用关系，以实现计算机的虚拟验证。此外，分子对接存在虚拟筛选的作用，通过虚拟对接所需的结合能以判断分子的结合活性。进行分子对接之前，需依据上述所得药物活性成分、核心共靶点结果，进行再次筛选后方可实行分子对接，在TCM-SP中进行查询并获得活性成分的mol 2 结构；在蛋白质结构数据库（protein data bank，PDB）中检索核心靶点，选择并保存其pdb 格式文件。准备对接前的配体和受体，首先由AutoDock 软件对药物活性成分进行加氢、计算电荷等操作，处理成配体，接下来用pymol 对核心靶点蛋白结构进行去配体、加氢、去水等操作，处理蛋白成受体，设置Atoms为Assign AD4 type，处理好的文件均保存为pdbqt格式。采用拉马克遗传算法准备docking 文件，进行柔性对接，最后用pymol 将所得配体与受体进行分子对接可视化展示。

2 结果

2.1 六君子汤药物活性成分及靶点蛋白筛选运用R 软件实现在TCM-SP 中收集六君子汤活性成分，完成筛选后共获得：党参活性成分17个，茯苓活性成分6个，白术活性成分4个，陈皮活性成分5个，半夏活性成分11 个，甘草活性成分88 个。将所有活性成分对应靶点进行合并去重，统一基因名后得到潜在靶点蛋白218个。

2.2 GID 相关靶点筛选疾病相关靶点，其中，DisGeNET 中获得15 个靶点，GeneCards 所得数据在Excel 中经过三次中位数卡值后获得1362 个靶点，OMIM中经去重后获得44个靶点，将所有疾病靶点合并去重后得到1376个靶点蛋白。

2.3 六君子汤-成分-靶点蛋白-GID 交集靶点网络将药物靶点与疾病靶点输入Venny2.1.0 网络平台，得到交集靶点Venn 图（见图1），共108 个交集靶点；用108 个靶点输入STRING 库，选择minimum required interaction score 为0.9，得PPI 图（见图2），图中包含108 个节点、451 条边，平均节点度值8.35，PPI富集P值＜1.0e-16；由Cytoscape 3.10.0 软件综合分析得到六君子汤-成分-靶点蛋白-GID交集靶点网络图（见图3）；导出网络分析文件，由度值降序排列选取前10 个成分为药物核心成分，即槲皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等（见表1）；再由所得PPI 网络导出tsv 文件，经Cytoscape 3.10.0 中Network Analyzer分析PPI网络，最终获得79个关键靶点（见图4A），选取2 次Degree 中位数7、11.5 进行筛选，最终获得PPI 中28 个靶点作为核心作用靶点（见图4B），分 别 为：STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1、RELA、MAPK14、IL6、TNF、IL10、MYC、MAPK8、ESR1、CREB1、EGFR、HIF1A、CDKN1A、STAT1、VEGFA、RB1、CCND1、CASP3、IL4、IL1B、CAV1、BCL2L1、IL2、BCL2。其中，度值排名靠前的5个靶点作为分子对接目标，分别为：STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1。

表1 六君子汤药物核心活性成分

图1 六君子汤与GID靶点交集韦恩图

图2 六君子汤与GID交集靶点蛋白PPI图

图3 六君子汤-成分-核心靶点-GID互作网络图

图4 六君子汤与GID核心交集靶点蛋白PPI网络优化图

2.4 富集分析进入微生信网络分析平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/），选择GO-KEGG 富集分析，提交79 个关键靶点[选择物种为“人类（Human，has）”]，获得富集分析图，根据P值（校正后P值）选取与GID 相关的前10 条。KEGG 富集分析中，主要包括：脂质与粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、前列腺癌（Prostate cancer）、糖尿病并发症通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、卡波西肉瘤相关病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、丙型肝炎（Hepatitis C）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、膀胱癌（Bladder cancer）、IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、弓形虫病（Toxoplasmosis）等（见图5）。

图5 六君子汤与GID的KEGG富集分析结果图

GO功能分析中，生物过程主要包括：细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、外源性凋亡信号通路（extrinsic apoptotic signaling pathway）、对活性氧的反应（response to reactive oxygen species）、氧化应激反应（response to oxidative stress）等；细胞组成主要包括：膜筏（membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）、膜区（membrane region）、小凹（caveola）等；分子功能主要包括：细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、DNA 结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）等（见图6）。

图6 六君子汤与GID的GO功能分析结果图

2.5 分子对接结果依据“药物-成分-核心靶点-疾病”网络中的度（degree）值，选取degree值排名靠前的5个活性成分与核心靶点进行分子对接。根据PPI网络及“通路-靶点-疾病”网络筛选核心靶点，本次研究选取槲皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚分别与STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1 靶点蛋白进行分子对接，结合能情况见表2。结果显示普遍结合能小，结合活性高，结合能均小于-5 kal/mol，其中豆甾醇与核心靶点AKT1对接效果最好；而7-甲氧基-2-甲基异黄酮与核心靶点STAT3对接效果最差。分子对接过程中，选取部分可视化对接结果，见图7。

表2 六君子汤与GID 分子对接结合能

图7 六君子汤与GID分子对接部分可视化结果图

3 讨论

六君子汤用于治疗危重症中GID脾虚证患者，具有限制机体炎症反应、调节免疫功能、改善肠道菌群等临床疗效[9，10]。本次分析结果发现，与治疗GID 相关的主要活性成分包括：槲皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等化合物。其中槲皮素度值最高，表明其参与并作用的靶点最丰富，有研究表明其在机体内可通过调节PTEN/PI3K/AKT 和JUK 信号通路抑制炎症因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）释放[11，12]；或通过激活PI3K/AKT/mTOR 通路，改善脓毒症小鼠心肌炎症以及氧化应激反应[13，14]；并可促进糖原合成，发挥降糖作用[15]；还可调控MAPK 信号通路，促进修复被破坏的肠道黏膜屏障，增强肠道免疫[16，17]，有效维护机体肠道稳态。由此可见，中药成分中单一化合物可通过多种途径实现抗炎、抗感染、促免疫调节等作用，与槲皮素作用靶点多的结果相符合，同样反映出六君子汤治疗GID时作用于多靶点的复杂机制。具有抗炎作用的还有豆甾醇、木犀草素等成分，其中，豆甾醇通过与MAPK3等靶点结合参与抗炎[18]；木犀草素则通过激活SIRT1信号通路，抑制NFκB 相关炎症反应，改善胃肠道功能[19]。由此可推测，针对GID 相关的炎症反应，无论炎症是原因还是结果，六君子汤应用在GID的抗炎治疗中具有一定的临床指导意义。一方面，木犀草素和黄芩素能与CYP1A1 蛋白结合，而CYP1A1 基因的高表达能破坏机体免疫防御能力，其中黄酮类成分能抑制该蛋白活性[20]；党参中的多糖、黄酮和皂苷等成分已被证明与改善机体免疫相关，是否与调节GID 免疫相关，其机制及疗效尚不明确，但却为后续的免疫相关研究指出了前进方向。另一方面，木犀草素还能通过PI3KAKT、MARK 和TNF 等信号通路，调节胃肠运动相关的神经递质表达，修复屏障，改善肠动力[21]；同时柚皮素与川陈皮素同样具有促进胃肠动力的作用[22]，表1显示，川陈皮素的OB 和DL 均较高，说明口服给药治疗GID 可达到较好的疗效。β-谷甾醇作为参与治疗GID的主要活性成分，发挥着降低血脂、退热消炎、抗氧化应激、增强免疫等作用[23，24]。六君子汤在这些化学成分的共同作用下，通过调节不同通路实现治疗目的，因此，其成分的探明为新药的设计提供了新思路。

靶点蛋白中STAT3 是人体细胞中信号传导和转录激活因子，研究表明受STAT3 调节的神经肽，可随STAT3 的下调，而调节胃肠激素，进一步改善胃肠运动[25]。AKT1 属于苏氨酸蛋白激酶家族，广泛存在于组织细胞中，参与机体细胞的增殖、生长、代谢等过程，是PI3K-AKT 通路中重要的调节分子，具有调控胃肠动力的能力[14]。靶点蛋白的存在使得药物活性成分能够准确地配对，知晓其作用位点，将调控信息向下游传导，以达到治疗疾病的效果。

KEGG 富集分析中，糖尿病并发症通路富集了较多的核心靶点蛋白，同时该信号通路与肠道炎症相关[26]；卡波西肉瘤相关病毒感染信号通路则表现出促炎性作用，诱导宿主细胞释放过量的vIL-6、IL-6 和IL-10细胞因子，加重机体免疫反应[27]，由此可推测这两条信号通路可能是控制GID炎性发展的重要通路，至于药物成分具体作用于何靶点及如何调节信号通路，可在未来进行进一步的通路分析实验验证。

分子对接中，结合能越小说明两者分子间契合度越高，结构越稳定。分子对接结果显示，豆甾醇与AKT1结合能最小，结合活性最高，代表二者分子之间结合越紧密和稳定，存在较强的相互作用。结合能最小的结果不是预想中度值排名最靠前的槲皮素和STAT3，抑或是表1 中OB、DL 较高的活性成分，说明分子对接的结果是否良好与上述三个因素相关性不大，而是可能与活性成分分子结构、靶标蛋白结构及分子间作用力相关。由表2可知AKT1与各药物活性成分结合能普遍较低，因此可推测六君子汤治疗GID时主要在改善胃肠动力方面的作用较稳定。

综上所述，六君子汤可能是通过槲皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等有效成分，作用于STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1 等靶点，参与糖尿病并发症通路、卡波西肉瘤相关病毒感染等信号通路的调节，发挥改善胃肠动力、抗炎、增强免疫、修复肠道屏障等作用，从而改善GID 患者预后。这符合中草药经多成分、多靶点、多途径协同治疗疾病的特点。本研究的不足之处在于数据挖掘不够全面，分子对接属虚拟验证层面，药理作用机制有待进一步的实验研究进行验证。